Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц

Общая цель данного эксперимента заключается в получении и определении характеристик наночастиц сульфата SD F1 Альфа Чиаса и декстрана. Получение наночастиц достигается путем предварительного смешивания фактора самонаведения стромальных клеток, полученного из стромальных клеток, одного альфа или S df одного альфа с сульфатом декстрана для обеспечения связывания с отрицательно заряженным гликаном. В качестве второго этапа озана в смесь добавляют положительно заряженный гликан, образуя полиэлектролитный комплекс с сульфатом декстрана.

Далее добавляется сульфат цинка для стабилизации комплексов с цинковыми мостиками. Полученная частица имеет плотное ядро, окруженное отрицательно заряженной оболочкой. Затем частицы измеряют их размер и дзета-потенциал, а также содержание и активность S df one alpha в наночастицах Основное преимущество наночастиц SDF one alpha заключается в том, что включенные в них SDF one alpha полностью активны, не высвобождаясь из частиц.

Таким образом, частицы могут быть полезны в качестве стационарного сигнала горностая при терапии стволовыми клетками. Для начала приготовьте исходные растворы, как описано в текстовом протоколе, и простерилизуйте их через фильтрующие мембраны толщиной 0,22 мкм. Оценивайте уровень эндотоксина в приготовленном растворе с помощью гелевого анализа сгустка лизата цитата амебы.

Следите за тем, чтобы уровень был менее 0,06 единицы эндотоксина на миллилитр. Далее по 0,18 миллилитров сверхчистой воды в стеклянный флакон объемом 1,5 миллитра, содержащий магнитную мешалку. Установите скорость перемешивания на 800 об/мин, затем добавьте 0,1 миллилитра 1%-ного сульфата декстрана и перемешайте через две минуты.

Добавьте 0,08 миллиграмм SD F1 альфа и перемешивайте в течение 20 минут. По каплям добавьте 0,33 миллилитра 0,1% тицена и перемешивайте в течение пяти минут. Измените скорость перемешивания на максимальную и медленно добавьте 0,1 миллилитра сульфата цинка с помощью герметичного шприца.

Верните скорость перемешивания на 800 об/мин и помешивайте в течение 30 минут. Затем добавьте 0,4 миллилитра 15%-ного маннита и через пять минут перемешайте. Переложите реакционную смесь в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при температуре 16 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и с помощью пипетки удалите последнюю каплю жидкости. Медленно добавьте 0,2 миллилитра 5% маннитола и суспензируйте гранулу с помощью шприца с иглой 29 калибра объемом 0,5 миллилитров. Затем добавьте еще один миллилитр 5%-ного манитола перед центрифугированием.

Второй раз в 16 000 GS на 15 минут. После повторения процесса центрифугирования суспензии Resus отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 0,2 миллилитра 5%-ного маннитола. Размер частиц и дзета-потенциал анализируются с помощью динамического и электрофоретического рассеяния света соответственно.

Для начала выберите операционную процедуру из списка СОП, который содержит параметры для измерения размера частиц с помощью динамического рассеяния света. Как указано в текстовом протоколе, разведите образец альфа-частиц SD F1 водой. Затем загрузите 100 микролитров образца в одноразовый UV Q Vet, такой как Einor Q Vet.

Вставьте Q vet в держатель ячейки и подождите, пока регулировка интенсивности достигнет оптимальной, прежде чем начать сбор данных. После завершения измерения запишите результаты кумулятивного измерения диаметра и индекса полидисперсии. Усреднить результаты, полученные по каждому из четырех повторяющихся показаний, и вычислить стандартное отклонение для измерения дзета-потенциала через электрофоретическое рассеяние света.

Загрузите в проточную ячейку 500 микролитров десятикратно разбавленной пробы частиц. Выберите операционную процедуру из списка потенциальных СОП «Зета», который содержит параметры для измерения, перечисленные в текстовом протоколе. Запишите результаты исследования дзета-потенциала.

Затем усредните результаты, полученные по каждому из пяти повторных показаний, и рассчитайте стандартное отклонение. Разбавленные образцы свободного и связанного с частицами SD F1 альфа нагрейте в буфере для образцов laly при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Дважды обведите образцы вихрем в течение 10-минутного нагрева, чтобы полностью диссоциировать частицы после охлаждения образцов до комнатной температуры в течение двух минут, центрифуга имела 10 000 G в течение 0,5-1 минуты, чтобы снова сбить вихрь водного конденсата для хорошего перемешивания.

На этом этапе раствор образца должен быть прозрачным без видимого осадка. Затем загрузите 10 микролитров образца в лунку в 4-20% сульфат натрия ESAL или гель SDS. Запустите электрофорез при напряжении 200 вольт в течение 20 минут, прежде чем окрашивать гель синим белком кумаси.

Исследуйте плотность полосы белка SD F1 альфа с помощью молекулярного имиджера и программного обеспечения для анализа денситометрии. Рассчитайте количество S DF one alpha в частицах по сравнению со стандартной кривой, построенной со свободными стандартами SDF one alpha для выполнения анализа in vitro release mix SD F1 альфа гликан частиц с докос фосфатным буферным солевым раствором без кальция и магния или DPBS в соотношении один к одному. Разделите суспензию частиц на аликвоты по 0,05 миллилитров в пробирках объемом 1,5 миллилитров.

Загрузите образцы на дно пробирок. Не допускайте попадания пузырьков воздуха и не нарушайте поверхность жидкости. Запечатайте верхнюю часть трубочек параформом.

Затем поверните трубки на 37 градусов Цельсия на вращающемся микротрубочном миксере. Удалите аликвоты из пробирок в назначенное время и немедленно центрифугируйте образцы при 16 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия после центрифугирования. Отделите надосадочную жидкость и гранулы.

Затем восстановите гранулу с 0,05 миллилитров DPBS. После того, как все образцы собраны, исследуйте надосадочную жидкость и гранулы на геле SDS. Как и ранее, этот анализ измеряет хемотаксическую активность S df.

Одно альфа-взаимодействие S df one alpha с его рецептором вызывает миграцию клетки в сторону градиента SD F1 альфа. Для начала разбавляют свободную или связанную частицами форму SD F1 альфа с миграционным буфером в трехкратном последовательном разведении до конечных концентраций, указанных в текстовом протоколе. Добавьте 0,6 миллилитра разведенного раствора SD F1 альфа в лунку в 24-луночном планшете для отрицательного контроля.

Проделайте то же самое для буфера миграции, только затем добавьте 0,57 миллилитров буфера миграции в лунку для управления входной ячейкой. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем поместите проницаемую вставку для клеточных культур, такую как transwell, на верхнюю часть нижней лунки, загрузите 0,1 миллилитра клеток джерк-шляпы во вставку transwell.

Затем загрузите 0,03 миллилитра ячеек непосредственно на входной элемент управления ячейкой. Хорошо инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов в инкубаторе с содержанием углекислого газа 5%. После инкубации удалите вкладыши для клеточных культур.

Переложите ячейки, которые перекочевали в нижние лунки, в четырехмиллилитровую полистирольную трубку. Подсчитайте мигрировавшие клетки с помощью проточного цитометра. Наконец, рассчитайте миграцию в процентах от числа входных ячеек после вычитания чисел в отрицательных элементах управления.

Здесь представлен анализ измерения размера частиц озана альфа-декстрансульфата SD F1. Результат CUMUL показывает, что гидродинамический диаметр частицы составляет 671 нанометр, а полидисперсия — 0,24. На этом скриншоте показано одно из пяти повторных измерений дзета-потенциала частиц озана дистанции SD F1 альфа DExT.

Дзета-потенциал составляет минус 24,7 милливольта. Количество S df one alpha в частицах S df one alpha dextan sulfate ozan оценивается с помощью гель-электрофореза SDS. Здесь показан окрашенный гель SDS кумаси с загруженными образцами контрольных наночастиц сульфата сульфата кайзана стандарта SD F1 и наночастиц альфа-декстрана сульфата кайзана SD F1.

Стандартная кривая строится на основе анализа плотности SD F1 Альфа Стандартные полосы расчет из стандартной кривой показывает, что концентрация S DF one alpha в образце SDF one alpha составляет 0,03 миллиграмма на миллилитр. Для определения in vitro скорости высвобождения S DF one alpha из наночастиц, количества высвобожденного S DF one alpha в супернате и количества связанных частиц sdf one alpha в гранулах определяли путем окрашивания кумаси геля SDS с последующим цитометрическим анализом. Активность связанной частицы S DF one alpha измеряется с помощью миграционного анализа и сравнивается с ним свободной SDF one alpha, как показано здесь.

Связанная с частицей SDF одна альфа индуцировала такую же степень миграции, как и свободная частица DF 1 альфа во всех измеренных концентрациях. Пытаясь использовать эту процедуру, важно помнить, что состав частиц гликанового белка может быть изменен. В зависимости от конкретного применения могут быть добавлены другие белки, а для изменения размера частиц могут использоваться различные составы.

Мы надеемся, что в этом видео будут продемонстрированы основные методы подготовки к сбору наночастиц и последующему функциональному анализу встроенного SDF one alpha.