Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за изменением заряда клеточной мембраны после адгезии к различным материальным субстратам. Для этого микроорганизмы культивируют в богатой питательной среде для увеличения их численности. Затем поверхности материалов, к которым будут прикрепляться микроорганизмы, очищают и функционализируют для достижения оптимальной скорости микробной адгезии.

Затем микроорганизмы высевают на различные материальные подложки для проведения визуализации методом зондовой силованной микроскопии Кельвина (KPFM). Результаты показывают, что тип материала подложки и его собственный заряд влияют на активность клеток, что проявляется в изменении заряда клеточной мембраны и адгезии клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как электрофоретический анализ, светорассеяние и определение изоэлектрической точки, является то, что KPFM позволяет исследовать заряд отдельных клеток и биопленок, а не целых культур или колоний.

Это удобно при необходимости сравнения электрических характеристик отдельных клеток и биопленки с высокой точностью и воспроизводимостью. Для начала приготовьте чашки с 5% кровяным агаром овечьей крови, произведите посев бактерий MRSA на подготовленные чашки и инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C для получения отдельных изолированных колоний. Приготовьте 500 мл триптиказного соевого бульона с добавлением 1% глюкозы и 0,1% хлорида натрия; подвергните автоклавированию бульон вместе с двумя чистыми стеклянными пробирками и одним набором наконечников для дозатора на 1 мл.

После охлаждения среды и пробирок в боксе биологической безопасности или рядом с горелкой, внесите по 6 мл TSB в каждую пробирку. Используя одну из заранее подготовленных чашек с агаром с кровью овцы, инокулируйте одну колонию MRSA в одну из пробирок. Вторую пробирку используйте в качестве отрицательного контроля для проверки стерильности. Инкубируйте пробирки в ротационном инкубаторе в течение 24 часов при 37 °C и 200 RPM.

В пробирке с MRSA должен наблюдаться рост, а в контрольной пробирке рост должен отсутствовать. Затем создайте субкультуру, используя один миллилитр 24-часовой культуры для инокуляции шести миллилитров свежего триптиково-соевого бульона, и инкубируйте при 37 °C и 200 RPM еще в течение шести часов. После этого перенесите один миллилитр культуры в пробирку для центрифугирования и центрифугируйте при 850 ×g в течение трех минут.

Удалите осадок и с помощью пинцета в доминирующей руке дважды промойте его деионизированной водой. Возьмите стальной диск для образцов FM диаметром 20 millimeter и очистите каждую сторону, используя пять миллилитров деионизированной воды. Поместите очищенные диски в стакан с деионизированной водой и подвергните воздействию ультразвука в течение одной минуты.

С помощью пинцета извлеките диски с образцами из стакана и прислоните их под углом примерно 60 градусов к краю открытой чашки Петри на бумажном полотенце. Для полного высыхания накройте высыхающие диски крышкой от чашки. После высыхания перенесите диск в чашку Петри для функционализации поверхности диска. В боксе биологической безопасности пипеткой нанесите на диски от 200 до 400 µL 0,1% полилизина и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, удерживая диски пинцетом.

Используйте деионизированную воду для их промывки, как было показано ранее в этом видео. Затем нанесите от 200 до 400 µL ресуспендированных клеток, прошедших двойную промывку, на покрытые диски с образцами. После инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут осторожно промойте диски, используя 1 mL деионизированной воды.

Дайте дискам высохнуть в течение ночи перед проведением визуализации методом силовой микроскопии кельвиновского зонда. Включите компьютер, а также атомно-силовой микроскоп (АСМ), HEB и контроллер MAC three. Откройте программное обеспечение для АСМ-визуализации, например, Ulence P ovu overview.

Выберите A-C-A-F-M или соответствующее обозначение для получения изображений в режиме прерывистого контакта. Используя FM-пинцет в доминирующей руке и удерживая зажим с пружиной в другой руке, осторожно установите кантилевер A-K-P-F-M в головку сканера. Осторожно установите головку в A FM и подключите провода лазерного излучателя и мотора подъема предметного столика.

Затем настройте лазер так, чтобы он попадал на кончик кантилевера. Для этого несколько раз поверните ручку перемещения «вперед-назад» по часовой стрелке, чтобы переместить лазер на поверхность чипа с кантилевером.

Когда лазер достигнет чипа, он будет перекрыт и перестанет быть видимым. Затем поворачивайте ручку регулировки «спереди-назад» против часовой стрелки до тех пор, пока лазерное пятно не появится снова. Теперь лазер находится на краю чипа.

Поверните ручку регулировки «влево-вправо», чтобы направить лазер на консоль. Когда лазер пройдет над консолью, он будет быстро исчезать и снова появляться. Пятно лазера должно быть видно на матовом стекле крышки, где позже будет размещен блок фотодиода.

Поверните ручку перемещения вперед-назад против часовой стрелки, чтобы сместить пятно вниз по консоли по направлению к игле, пока пятно на матовом стекле не исчезнет. Теперь слегка поверните ручку перемещения вперед-назад по часовой стрелке, чтобы расположить лазер точно на кончике иглы; при этом пятно лазера снова появится на матовом стекле. После выравнивания лазера удерживайте мотор подъема предметного столика в открытом положении в течение 10 секунд, чтобы обеспечить достаточное расстояние между консолью и образцом.

При установке образца в А FM поместите образец на предметный столик KPFM. Используйте медный провод для заземления образца и подключите соответствующие провода от А FM к столику с образцом. Затем подключите столик к А FM в программном обеспечении А FM.

Убедитесь, что время установки составляет не более 10 мс, а скорость приближения не превышает 2 мкм/с. Чтобы избежать повреждения зонда, настройте кантилевер и начните перемещать его кончик к образцу. Как только кончик кантилевера достигнет поверхности образца, выберите размер окна визуализации и оптимальную область сканирования, затем оптимизируйте коэффициенты усиления интегрального (I) и пропорционального (P) регуляторов, а также уставку кантилевера для достижения оптимального качества топографического изображения.

После оптимизации топографического изображения включите модуль KPFM в режиме FM. Установите размер окна сканирования 5 µm на 5 µm с разрешением 512 на 512 пикселей или используйте низкую скорость сканирования. В настройках FM KPFM установите амплитуду воздействия (drive) в диапазоне от 5 до 10%. Установите частоту воздействия в диапазоне от 1 до 5 kHz с шириной полосы пропускания 2 kHz.

Установите коэффициент усиления для железных наночастиц (NP) для F-M-K-P-F-M на 0,3%. После получения изображений KPFM используйте программное обеспечение для постобработки, чтобы проанализировать изображения и собрать данные SP, используя настройки, описанные в данном демонстрационном видео. Изображения KPFM были получены для 15 клеток MRSA как на поверхностях из нержавеющей стали, так и из золота. Здесь показаны типы полученных изображений.

Поскольку KPFM работает на двух частотах, топографические изображения и электрические данные поверхности клетки собирались одновременно. К картам поверхностного потенциала применялись тепловые фильтры, чтобы легче распознать небольшие изменения потенциала поверхности. На данном графике изображения были проанализированы для определения поверхностного потенциала микробной мембраны, а затем использованы для сравнения роста на различных субстратах.

Сканирование поверхностного потенциала подложек из чистого нержавеющей стали и чистого золота показало в целом отрицательный поверхностный потенциал. Диски из нержавеющей стали и золота с полиолизолизиновым покрытием продемонстрировали сдвиг в сторону положительных поверхностных потенциалов. Потенциалы клеточных мембран MRSA различались для поверхностей из нержавеющей стали и золота.

При этом нержавеющая сталь демонстрировала значительно более высокий положительный поверхностный потенциал мембраны клеток по сравнению с клетками MRSA на золотой подложке, которые проявляли отрицательный поверхностный потенциал. Чтобы продемонстрировать все возможности KPFM, здесь представлен пример графика перепада высот для MRSA на нержавеющей стали. На нем показана разница поверхностного потенциала между поверхностью подложки и микробной мембраной.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать силовую микроскопию зондом Кельвина для изучения влияния электрического заряда на прикрепление и активность микробных клеток на поверхностях различных материальных субстратов.