Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за изменениями заряда клеточной мембраны после прилипания к различным материальным субстратам. Это достигается путем культивирования микроорганизмов в богатой питательными веществами среде для увеличения их численности. Затем поверхности материала, к которым будут прилипать микроорганизмы, очищаются и функционализируются для оптимальной скорости прикрепления микроорганизмов.

Затем микроорганизмы наносятся на различные материальные подложки для проведения зондовой микроскопии Кельвина или визуализации КЗСМ. Результаты показывают, что тип субстрата материала и присущий ему заряд влияют на активность клетки, что проявляется в изменениях заряда клеточной мембраны и адгезии клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как электрофоретическое, светорассеяние и определение изоэлектрических точек, заключается в том, что КЗСМ позволяет исследовать заряд отдельных клеток и биопленок, а не целых культур или колоний.

Это полезно, когда вы хотите сравнить электрические характеристики между клетками, а также биопленку с высокой точностью и точностью. Для начала приготовьте 5%-ные агаровые пластины из овечьей крови, нанесите бактерии MRSA на подготовленные пластины и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия для создания одиночных хорошо изолированных колоний. Приготовьте 500 миллилитров соевого бульона триптиха, дополненного автоклавом 1% глюкозы и 0,1% хлорида натрия, вместе с двумя чистыми стеклянными пробирками и одной коробкой по одному миллилитру пипетки.

Дав среде и пробиркам остыть под шкафом биобезопасности или рядом с булочками и конфоркой, нанесите пипеткой шесть миллилитров TSB в каждую пробирку. С помощью одной из заранее приготовленных агаровых пластин с овечьей кровью введите одну колонию MRSA в одну из пробирок. Используйте вторую пробирку в качестве отрицательного контроля для обеспечения стерильности: инкубируйте пробирки в обратном инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин.

Пробирка MRSA должна показать рост или в контрольной пробирке ничего не должно было расти. Затем создайте субкультуру, используя один миллилитр из 24-часовой культуры для инокуляции шести миллилитров свежего триптического соевого бульона и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение еще шести часов. Затем пипеткой нанесите один миллилитр культуры в пробирку AFUS и центрифугируйте при 850-кратном G в течение трех минут.

Удалите супинат и с помощью деионизированной воды промойте гранулу два раза щипцами в доминирующей руке. Держите 20-миллиметровый диск из нержавеющей стали FM и используйте пять миллилитров деионизированной воды для очистки каждой стороны. Поместите чистые диски в стакан с деионизированной водой и обрабатывайте ультразвуком в течение одной минуты после обработки ультразвуком.

С помощью щипцов извлеките диски для образцов из стакана и прислоните их под углом примерно 60 градусов к краю открытой чашки Петри на бумажном полотенце. После высыхания переложите диск в чашку Петри, чтобы придать поверхности диска форму. Пипеткой нанесите от 200 до 400 микролитров 0,1% полиоллизина на диски в биобезопасном шкафу и инкубируйте комнатную температуру в течение одного часа, используя щипцы для удержания дисков.

Используйте деионизированную воду для их промывки, как показано ранее в этом видео. Следующая пластина, от 200 до 400 микролитров ресуспензионных клеток, которые были дважды промыты на диски с покрытием образцов. После инкубации комнатной температуры в течение 30 минут аккуратно используйте один миллилитр деионизированной воды для промывания дисков.

Дайте дискам высохнуть в течение ночи перед визуализацией для проведения микроскопии Kelvin Probe Force. Включите компьютер вместе с атомно-силовым микроскопом или АСМ, HEB и MAC три контроллера. Откройте программное обеспечение для обработки изображений A FM, например Ulence P ovu overview.

Выберите A-C-A-F-M или правильное обозначение для визуализации в режиме прерывистого контакта. Используя щипцы FM в доминирующей руке и держа подпружиненный держатель зажима открытым в другой руке, осторожно поместите консоль A-K-P-F-M в головной передатчик. Осторожно загрузите головной передатчик в A FM и подключите провода лазерного фонаря и двигателя сценического подъемника.

Затем направьте лазер на кончик консоли. Чтобы выровнять лазер по кончику консоли. Поверните переднюю и заднюю ручку по часовой стрелке несколько раз, чтобы переместить лазер на верхнюю часть консольного чипа.

Когда лазер достигнет чипа, он будет заблокирован и больше не будет виден. Затем поворачивайте переднюю и заднюю ручки против часовой стрелки, пока лазерное пятно не появится снова. Теперь лазер находится на краю чипа.

Поверните ручку слева направо, чтобы расположить лазер на консоли. Когда лазер проходит над консолью, он будет исчезать и появляться снова в быстрой последовательности. Лазерное пятно должно быть видно в крышке из матового стекла, где позже будет установлен фотодиодный блок.

Поверните ручку спереди назад против часовой стрелки, чтобы переместить пятно вниз по консоли к кончику, пока пятно на матовом стекле не исчезнет. Теперь слегка поверните ручку спереди назад по часовой стрелке, чтобы расположить лазер так, чтобы он находился прямо на кончике консоли, лазерное пятно снова появится на матовом стекле. После того, как лазер будет выровнен, удерживайте двигатель подъема предметного стола в открытом положении в течение 10 секунд, чтобы обеспечить достаточное пространство между консолью и образцом.

При подключении образца к A FM поместите образец на столик KPFM. Используйте медный провод для заземления образца и подключите соответствующие провода от A FM к предметному столику. Затем подключите сцену к A FM в программном обеспечении A FM.

Убедитесь, что время настройки составляет не более 10 миллисекунд, а скорость сближения не превышает двух микрон в секунду. Во избежание повреждения наконечника настройте консоль и начните перемещать наконечник консоли по направлению к образцу. После того как кончик кантилевера достигнет поверхности образца, выберите размер окна визуализации и идеальную область визуализации, оптимизируйте прирост глаз и фосфора вместе с заданной точкой кантилевера, чтобы оптимизировать топографические изображения.

Когда топографическая съемка оптимизирована, включите модуль КЗСМ в FM-режиме. Установите окно визуализации на пять микрон на пять микрон с пятью разрешениями 12 на пять 12 или медленной скоростью сканирования. Для настроек FM KPFM установите привод в диапазоне от пяти до 10%Установите частоту привода в диапазоне от одного до пяти килогерц с пропускной способностью два килогерца.

Установите коэффициент усиления NP для F-M-K-P-F-M на 0,3%После получения изображений KPFM используйте программное обеспечение для обработки изображений для анализа изображений и сбора данных SP с настройками, описанными в этой демонстрации видео. Изображения KPFM были получены на 15 ячейках MRSA на поверхностях из нержавеющей стали и золота. Здесь показаны типы собранных изображений.

Поскольку КЗСМ работает на двух частотах, топографические изображения и электрические данные поверхности клетки были собраны одновременно. Тепловые фильтры были применены к картам поверхностных потенциалов, чтобы легче различать небольшие изменения поверхностного потенциала. На этом графике изображения были проанализированы для определения поверхностного потенциала микробной мембраны, а затем использованы для сравнения роста на различных субстратах.

Сканирование поверхностных потенциалов подложек из нержавеющей стали и голого золота показало общие отрицательные поверхностные потенциалы. Диски из нержавеющей стали и золота с покрытием из полиол-лизина продемонстрировали сдвиг в сторону положительных поверхностных потенциалов. Потенциалы клеточных мембран MRSA варьировались между поверхностью нержавеющей стали и золота.

При этом нержавеющая сталь демонстрирует значительно больший положительный поверхностный потенциал мембраны для клеток по сравнению с клетками MRSA на золотой подложке, которые показали отрицательные поверхностные потенциалы. Чтобы продемонстрировать все возможности KPFM, здесь приведен пример графика высоты ступени MRSA на нержавеющей стали. Это показывает разницу в поверхностном потенциале между поверхностью субстрата и микробной мембраной.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как использовать зондовую силовую микроскопию Кельвина для изучения влияния электрического заряда на прикрепление микробных клеток и активность на различных поверхностях материального субстрата.