3D-моделирование боковых желудочков и гистологического Характеристика Перивентрикулярные тканях человека и мыши

Общая цель следующих процедур состоит в том, чтобы предоставить средства, позволяющие исследовать причину и следствие желудочкового магали, а также выделить методы, которые позволяют изучать здоровье желудочковой системы и ее важные барьерные и фильтрационные функции в мозге. Это достигается путем сбора либо корональных срезов мозга мыши, либо МРТ-сканирования человеческого мозга для создания 3D-реконструкции желудочков и расчета объемов желудочков в качестве второго шага посмертной ткани, которая включает в себя препараты апикальной поверхности желудочков, окрашивается клеточно-специфическими антителами для выявления клеточной целостности слизистой оболочки желудочка. Затем подготавливается монтаж клеточной организации на всей поверхности желудочка и визуализируется на 3D-модели желудочка для демонстрации областей глиоза в сравнении с интактными придаточными клетками.

Результаты показывают области расширения желудочков на основе продольного 3D-моделирования желудочков и областей, где придаточный темальный слой выстилки желудочка уже не интактирован, а заменен глиальными рубцами. Комбинируя данные 3D-моделирования с иммуногистохимическими данными, можно создать 3D-карту клеточного состава слизистой оболочки желудочка для конкретного региона. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику черепно-мозговых травм, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, и нормального старения, все из которых обычно демонстрируют некоторый уровень расширения желудочков и, следовательно, вероятный сколиоз поверхности желудочка.

Демонстрировать процедуры на мышах будет Ричард Вольффер, а студентам нашей лаборатории будут продемонстрированы процедуры, выполненные с использованием данных МРТ человека, и посмертные человеческие ткани. В настоящее время студентка-медик и Ребекка Чу, аспирантка лаборатории. Подготовьте предметные стекла для визуализации путем фиксации, разреза, иммуноокрашивания и монтажа мозга мыши, как указано в письменной части протокола Чтобы начать процедуру, проследить боковые желудочки мыши с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа и компьютера, микроскоп должен быть оснащен автоматизированным столиком и цифровой ПЗС-камерой.

Запустите картографическое программное обеспечение в флуоресцентном режиме, откройте параметры отображения для загрузки панелей инструментов и панелей стыковочного бассейна, необходимых для трассировки. Далее нажмите на опции, отобразите опции аксессуаров и выберите главную и маркерную панели инструментов в том же меню. В разделе Панели док-пула выберите гистограмму камеры, многоканальное управление, настройки камеры и получение изображений.

Определите первый участок ткани, содержащий боковые желудочки, на основе сильной флуоресценции S 100 beta, которая помечает придаточные клетки. Выстилка бокового желудочка. Сориентируйте левое и правое полушария, определив небольшой разрез, сделанный во время разреза.

Теперь создайте новый файл данных и назначьте точку отсчета для движения этапа, щелкнув в окне изображения над левым боковым желудочком. Держите эту точку отсчета в постоянном месте относительно боковых желудочков в файлах трассировки. Чтобы упростить импорт контуров для последовательной реконструкции, выберите соответствующий предустановленный тип контура в раскрывающемся меню контуров.

Используйте уникальный цвет для каждой из трассировок левого и правого бокового желудочка. Теперь щелкните по всей апикальной поверхности выстилки придатка, чтобы проследить контур желудочка. Перемещайте окно трассировки с помощью клавиш со стрелками.

После обводки контура щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Закрыть контур». Повторите трассировку для правого желудочка, используя другой цвет. Затем выберите соответствующий маркер на панели инструментов маркеров слева и нажмите, чтобы перетащить маркер на экран трассировки вдоль средней линии, чтобы помочь в выравнивании серийных контуров для 3D-реконструкции.

Повторите эту процедуру, чтобы сделать вторую отметку. Сохраните следы тканей, выбрав файл Сохранить файл данных как и создайте новую папку и имя файла, номер трассы в соответствии с соглашением, номер слайда, номер тире, номер ткани для легкой идентификации следов из серийных срезов. Затем повторите только что показанную процедуру для всех отделов, содержащих желудочек.

Провести 3D реконструкцию бокового желудочка. Откройте программу 3D реконструкции. Затем нажмите кнопку "Открыть файл" и выберите файл контура первого последовательного участка трассировки.

Импортируйте все контурные контуры левого и правого желудочков, а также все добавленные маркеры. Выровняйте контуры в соответствии с инструкциями в письменной части протокола. Затем выберите все контуры на левой панели, а затем нажмите кнопку 3D визуализации, чтобы отобразить окончательную 3D реконструкцию.

На этом изображении показан участок головного мозга корональной мыши, включая боковые желудочки, очерченные иммунореактивными придаточными клетками S 100 beta. Звездочкой обозначены боковые желудочки. Скобки обозначают адгезию, а масштабная линейка представляет 500 микрон.

Боковые желудочки мыши прослеживаются в виде контуров и располагаются в виде подсегментов. Области внутрижелудочкового вмешательства исключаются от помех при объемном анализе. На этом изображении показана окончательная 3D-реконструкция контуров бокового желудочка.

Желтый цвет представляет собой контур целых объемов мозга, охватывающих исследуемую область, содержащую боковые желудочки. Вы должны хорошо понимать, как создавать 3D-реконструкции желудочков ткани мозга, срезанной Corona Протоколы перечислены для создания реконструкции 3D-изображений и объемной количественной оценки боковых желудочков, а также для оценки объемных изменений с течением времени с использованием анализа продольного наложения, важно отметить, что согласованность в МРТ. Сбор данных R и обработка после сбора данных являются чрезвычайно важными критериями для включения наборов данных Для выполнения сегментации желудочков используется ITK SNAP для сегментации желудочков по взвешенным МР-изображениям с высоким разрешением. После запуска программы откройте изображение в оттенках серого, выберите нужный файл и откройте его как изящный файл.

Затем прокрутите каждую анатомическую плоскость и обратите внимание на аномалии желудочков, такие как области носа, большие или маленькие височные рога и тому подобное. Далее в главном наборе инструментов нажмите змейку, инструмент ROI. Затем сегментируйте 3D и выберите опцию области интенсивности.

Теперь нажмите «Предварительно обработать изображение» и выберите выше. Запишите максимальную интенсивность с помощью ползунка. Затем установите пороговое значение на 15% от максимальной интенсивности и запишите это значение.

При этом ROI должен быть выделен белым цветом. Установите параметр гладкости равным 10. Нажмите OK.

Затем далее. Далее добавьте от 10 до 12 маленьких по два пузырька на каждый желудочек. Два в переднем лобном роге, семь равномерно расположены вдоль верхней поверхности тела бокового желудочка, один в затылочном роге и один в височном роге бокового желудочка.

Далее выбираем параметры и устанавливаем силу кривизны равным 0,4. Затем нажмите на символ воспроизведения, чтобы начать активную эволюцию контуров. Теперь нажмите кнопку Обновить сетку, чтобы визуализировать поверхность.

Затем проверьте автообновление. Прекращают процесс сегментации, когда все участки бокового желудочка включены в интересующую область. Следует избегать включения третьего желудочка.

Наконец, нажмите «Готово» и сохраните результаты сегментации в удобном формате файла. Чтобы получить общий объем желудочка, выберите сегментацию, объем и статистику получить общий объем желудочка с помощью заданной цветовой метки. В этом сегменте продольные ROI накладываются с помощью программного обеспечения Mango, чтобы качественно и количественно продемонстрировать изменения объема желудочков у испытуемых с течением времени.

После открытия программы нажмите «Открыть», откройте файл, загрузите ранее сохраненный файл nifty. После загрузки файла изображения нажмите кнопку Загрузка файла ROI и загрузите ROI базовой точки ROI для временной точки среднего значения, выделенной зеленым цветом. Нажмите кнопку Загрузить файл ROI и загрузите вторую временную точку ROI красным цветом.

Сохраните продольное наложение, выбрав Сохранить файл ROI Назначьте каждому изображению имя файла в соответствии с соглашением, отображаемым на экране. Затем откройте ITK snap. Затем повторно откройте объединенный ROI в виде загрузки изображения в оттенках серого комбинированный ROI, выбрав загрузку сегментации из объединенного файла ROI изображения, чтобы получить данные продольного объема, выполните следующую сегментацию объема и статистику.

Метка один красный равен объему расширения метка два зеленого равна объему стеноза этикетка три синего равна базовому объему, начиная с неповрежденного полушария, которое было зафиксировано в 10% формине максимум на шесть недель и тщательно промыто 0,1 молярным срезом PBS, корональными срезами толщиной 1,5 сантиметра по всему полушарию с помощью большого ножа с использованием микрохирургического скальпеля. Рассеките стенку желудочка на один сантиметр вглубь, сохраняя один непрерывный участок для всей боковой стенки, подразделяйте стенку по мере необходимости, чтобы создать участки соответствующего размера для окрашивания. Хорошо сделайте надрез на разрезе с противоположной стороны стенки желудочка.

Для определения верхней нижней ориентации проводят иммуногистохимический анализ и монтируют срезы в соответствии с письменным протоколом. Под препарирующим эндоскопом закрепите ткани с помощью булавок с помощью микрохирургического ножа, создайте равномерно тонкий участок стенки бокового желудочка и закрепите пенем в стороне на предметном стекле. Установите фокальную плоскость изображения на поверхности желудочка, как определено с помощью бета-катенина, маркера А для апикальной адгезии.

Соединительные белки придатковых клеток. Затем очертите области придаточного клеточного покрытия и поверхностного астроглиоза в соответствии с окрашиванием GFAP на поверхности желудочка, чтобы задокументировать и смонтировать всю поверхность желудочка. Используйте перекрывающиеся изображения всей поверхности для создания монтажа последовательных изображений.

Откройте Adobe Photoshop и используйте автоматизацию файлов автоматического создания интерактивного макета для выбора изображений для наложения, при необходимости внося ручные корректировки. Создайте новый слой для трассировки монтажа, чтобы создать мультяшное представление нетронутых. В зависимости от покрытия клеток или поверхности желудочка G сколиоза, составьте все срезы для реконструкции карты стенки желудочка и привязки к соответствующей области на реконструкции МРТ.

Это сборка изображений МРТ человека здесь. Латеральный желудочек был определен как область, представляющая интерес, красным цветом. Реконструкция 3D-изображения, как показано здесь, позволяет количественно оценить объем и качественную визуализацию бокового желудочка.

На этом изображении показана оценка продольного расширения желудочка у пожилого пациента. Продольные МРТ с нескольких точек могут быть выровнены и наложены друг на друга для визуализации и количественного определения увеличения объема желудочков у пациентов с течением времени. На последних трех изображениях показана иммуногистохимическая оценка и регионарное картирование поверхности бокового желудочка человека. Здесь.

Участки интактных придатковых клеток, очерченные бета-катином и окрашиванием, имеют вид булыжника, как указано звездочкой, и отграничены пунктирной линией от областей астроглиоза на поверхности желудочка, очерченных окрашиванием GFAP. Серийные конфокальные изображения накладываются друг на друга для создания регионального монтажа и обводятся с помощью Adobe Photoshop или мультяшного представления клеточной организации на поверхности желудочка. Это мультяшное изображение монтажа сопоставлено с поверхностью желудочка на соответствующей 3D-реконструкции желудочка на основе МРТ.

Как показано на рисунке, зеленым цветом обозначены неповрежденные придатки и красные участки глиоза. При выполнении этой процедуры важно вести тщательную документацию каждого образца ткани, чтобы выполнить серийную реконструкцию и картирование клеточной целостности. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как субсегментация боковых желудочков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся расширения региона с течением времени.