Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Общая цель этой процедуры заключается в выделении дофаминовых нейронов из срезов тканей на предметных стеклах. Это достигается путем предварительного разрезания замороженной вентральной ткани мезенцефалона либо на стилизованные слайды, либо на предметные стекла с перьевой мембраной. Далее дофаминовые нейроны помечаются с помощью быстрой флуоресцентной иммуногистохимии.

Затем ткань обезвоживается и загружается в лазерный микроскоп. Затем меченые дофаминовые нейроны прикрепляются к колпачку ЖКМ с помощью инфракрасного лазера, и выделяется интересующая РНК или молекула. Полученные результаты показывают, что для количественных измерений ПЦР с помощью лазерной фотоскопии можно получить РНК достаточного количества и качества.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как грубая диссекция или микроудары, заключается в том, что отдельные клеточные популяции могут быть изолированы или очень дискретными областями мозга. Чтобы подготовиться к погружению для выделения РНК, либо предметные стекла для подготовки селина, либо полиэтиленметилат, либо стекольные стекла с перьевой мембраной в раствор для обеззараживания и использовать свободную воду для РНК для их трехкратной промывки с использованием градуированной серии РНК без этанола, обезвоживайте предметные стекла и вакуумируйте в течение 30 минут с помощью криостата, разрезайте срезы ткани толщиной 10 микрон и установите на подготовленные РНК. Свободные предметные стекла сохраняют образцы замороженными во время среза для сохранения качества РНК.

Далее провести иммуногистохимию. С помощью гидрофобной ручки обведите контуром ткани и дайте им высохнуть, а затем смочите раствор ацетона метанола один к одному. Зафиксируйте ткань при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия на 10 минут После извлечения ткани из морозильной камеры накройте срезы от 100 до 200 микролитров антител к тирозингидроксилазе NPBS и 1% триттона на 10 минут.

Затем используйте PBS с 1%-ным триттоном для промывки предметных стекол, прежде чем покрыть срезы 100-200 микролитрами козьего антикроличьего IgG, помеченного Alexa Fluor 4 88, инкубируйте в течение пяти минут, а затем используйте PBS для промывания слайдов дважды. Затем обезвоживайте образцы с помощью интегрированного ряда РНК этанола в течение 30 секунд каждый, как было показано ранее в этом видео. Выдержать в ксилоле одну минуту и секунду, промыть пять минут.

Снимите предметные стекла непосредственно перед использованием для LCM и дайте им высохнуть на воздухе. После загрузки колпачков и слайдов LCM и настройки системы LCM в соответствии с текстовым протоколом, настройте и направьте ИК-лазерный захват на прочность. Поместите колпачок в область предметного стекла в стороне от ткани на панели инструментов лазера захвата.

Выберите включение, отрегулируйте импульс мощности и количество попаданий лазера. Запустите ИК-лазер, когда колпачок находится над частью предметного стекла без ткани, и проверьте, достаточно ли лазер расплавляет мембрану колпачка LCM. После регулировки интенсивности ИК-лазера щелкните правой кнопкой мыши и выберите захват лазера, чтобы направить лазер на выполнение ЖКМ на отдельных дофаминовых нейронах с подготовительных слайдов клайна.

Начните с перехода к интересующей вас области для захвата клеток, чтобы захватить отдельные клетки со стороны подготовки клайна. На панели инструментов микродиссекции выберите вкладку LCM, а затем значок одной точки. Затем на панели инструментов микроскопа используйте вкладку затвора для переключения между флуоресценцией и светлым полем с вкладками флуоресцентных фильтров, чтобы выбрать подходящие фильтры, и используйте вкладки объективов для изменения увеличения.

После того как интересующие ячейки станут видимыми в окне видеотрансляции, отрегулируйте размер пятна, используемого для обозначения интересующих ячеек, до приблизительного размера ячеек. Отметьте интересующие вас ячейки, выбрав значок одной точки, а затем щелкнув по ячейкам. После того, как ячейки будут отмечены на панели инструментов микродиссекции, выберите вкладку «Перейти к вырезке и захвату», и ИК-лазер автоматически выстрелит во все отмеченные ячейки.

Переместите колпачок из секции на открытую область предметного стекла, чтобы проверить, захвачены ли ячейки на колпачке LCM. Закончив сбор ткани, переместите колпачок, щелкнув правой кнопкой мыши по колпачку и выбрав «Переместить», а затем выгрузить, как указано в текстовом протоколе, используйте предметное стекло, обработанное для иммуногистохимии, в качестве руководства для выбора интересующей области из ткани на мембране ручки. На панели инструментов микродиссекции выберите вкладку «Резка и захват», затем выберите вкладку «Линия разреза» и, используя иммуногистохимический слайд в качестве руководства, наметьте интересующую область под объективом 10-кратного увеличения.

Испытайте, запустите и наведите инфракрасный и ультрафиолетовый лазеры, как было продемонстрировано ранее. В этом видео на панели инструментов микродиссекции выберите вкладку «Захват и вырезание». Затем снимите колпачок LCM с ткани, чтобы определить, удалена ли ткань из разреза, и прикрепите к колпачку.

Когда вы закончите сбор ткани для снятия колпачка, щелкните правой кнопкой мыши по колпачку и выберите «Переместить», чтобы затем выгрузить микрофотографии на этих рисунках демонстрируют, что LCM способен выделять отдельные нейроны тирозингидроксилазы, иммунореактивные дофаминовые нейроны с помощью ИК-лазера или ИК- и УФ-лазеров, потому что наиболее распространенным использованием клеток в тканях, выделенных с помощью ЛКМ, является анализ РНК. Представленные методики были оптимизированы для сохранения целостности РНК, о чем свидетельствует относительное уменьшение высоты пика RRNA 28 S по сравнению с пиком 18 S, снижение качества РНК в образцах LCM с более низкой целостностью после иммуногистохимии с последующей фиксацией ацетона по сравнению со всей РНК мозга. Для измерения количества РНК, полученной из нейронов, полученных с помощью L-C-M-R-N-A из дофаминовых нейронов из вентральной бирюзовой области от физиологического раствора, слайды были выделены на основе стандартной кривой, сгенерированной в общей сложности 17,3, 24,8 и 50,9 пикограмм на микролитр были выделены из 5, 100 и 200 дофаминовых нейронов соответственно.

С помощью КПЦР для измерения качества РНК диапазон концентраций РНК всего мозга и РНК из дофаминовых нейронов был перевернут, транскрибирован и ген бета-актина был измерен на основе этих измерений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать лазерный микроскоп для выделения отдельных дофаминовых нейронов или для выделения участков дофаминовых нейронов.