Технической точки зрения в современной годичных колец исследований - Как преодолеть Dendroecological и дерева Анатомические вызовы

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании хорошо воспроизведенной древесины с высоким разрешением. Анатомические наборы данных для изучения влияния времени и факторов окружающей среды на рост деревьев и кустарников. Это достигается за счет использования неньютоновской жидкости для стабилизации растительных клеток во время микротомного среза, что позволяет провести детальный микроскопический анализ образцов в качестве второго этапа.

Микросрезы окрашиваются дважды, чтобы облегчить дифференцировку одревесневших и неодревесневших клеток, а затем делаются цифровые изображения образцов. В конечном счете, может быть выполнен автоматизированный клеточный анализ роста растений и связанный с ним анализ временных рядов, позволяющий оценить интересующие анатомические параметры древесины. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что при использовании нашей методики ячейки не заполняются опилками, что приводит к получению гораздо более четких качественных образцов для анализа изображений.

Кроме того, добавление неньютоновской жидкости в клетки во время среза позволяет избежать трудоемкой техники погружения образца в парафин. Новые микротомы, которые мы увидим в видео, были разработаны в нашей лаборатории, расположенной в центральной части Лу Нетти в Шан Дабе и Цюрихе. Они выделяются благодаря высокой стабильности наведения, что позволяет резать большие и плотные экземпляры.

Для отбора проб керна стволов деревьев. Начните с размещения заостренного приращенного стержня перпендикулярно растущей оси ствола дерева. Затем сдайте керн и с помощью экстрактора удалите полученный образец керна из дерева.

Пометьте сердцевину специальным идентификатором, отмеченным мягким карандашом на поверхности стержня, и повторите процедуру на противоположной стороне стержня, когда все образцы будут собраны. Храните промаркированные ядра в соответствующей таре, чтобы защитить их от повреждений во время транспортировки. Затем, вернувшись в лабораторию, установите образцы керна вертикально на деревянные опорные балки с помощью водостойкого клея для дерева и дайте им высохнуть для отбора микрообразцов керна.

Во-первых, при необходимости удалите часть коры с помощью зубила. Затем поместите специальное пробивное приспособление перпендикулярно оси роста на только что продемонстрированный стебель, и с помощью молотка проникните ксилему стебля примерно на два сантиметра в глубину. Поверните пробивное устройство, чтобы сломать образовавшийся микросердечник внутри инструмента.

Затем извлеките сердцевину из стержня и храните ее в пробирке для микроцентрифуги с маркировкой. Чтобы вырезать плоскую поверхность на образце керна, начните с фиксации интересующего приращения ядра в держателе керна недавно разработанного микротома керна для резки плоских поверхностей на кернах по всей их протяженности. Затем поднимите сердечник до тех пор, пока он слегка не коснется лезвия, которое закреплено на шарикоподшипнике, направляя по всей длине сердечника, и потяните лезвие, чтобы разрезать первую часть верхней части сердечника.

Далее протолкните нож за сердцевину. Поднимите держатель образца примерно на 10 микрон и повторите процедуру резки примерно до одной трети керна. Диаметр уменьшается, в результате чего получается непрерывная гладкая поверхность.

Для детального анализа анатомического строения образцов необходимо подготовить микросрезы с другим типом микротома. Во-первых, закрепите интересующий образец керна в держателе микротома микротома. Затем расположите лезвие микротома, направляя его по шарикоподшипнику, и натяните лезвие на сердечник.

Отодвиньте лезвие, чтобы поднять образец на 20–30 микрон. Затем наведите лезвие на образец. Опять же, повторяем этот процесс до тех пор, пока на вершине образца не будет создана непрерывная поверхность.

Теперь с помощью малярной кисти покройте полученную поверхность раствором кукурузного крахмала. Затем поднимите образец на 15 мкм и поместите кисть на поверхность образца. Медленно потяните лезвия к образцу, начиная с тонкого разреза под щеткой и используя щетку, чтобы направить срез на поверхность лезвия, когда весь срез будет разрезан.

Используйте другую щетку и воду, чтобы удалить ткань с лезвия и поместите ее на предметное стекло, чтобы можно было различить одревесневшие и неодревесневшие структуры. Смойте глицерин водой с помощью пипетки. Далее накройте влажную часть несколькими каплями смеси шафрана и астро синего.

Через пять минут смойте красители водой, а затем немедленно обезвожьте участок с помощью последовательных обработок этанолом. После обработки обезвоженным этанолом повторно промойте секцию в 100% xol. Как только xol останется чистым.

Накройте ткань каплей 100% канадского бальзама и покровным стеклом, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха. Затем поместите получившуюся микрогорку между двумя полосками термостойкого пластика и поместите ее на металлическую пластину. Поместите груз на верхнюю часть предметного стекла, чтобы секция оставалась плоской, а затем поместите предметное стекло в духовку при температуре 60 градусов Цельсия.

Через 12 часов дайте предметному стеклу остыть до комнатной температуры, а затем снимите груз и пластиковую полоску. Наконец, очистите предметное стекло с помощью бритвенных лезвий, чтобы удалить излишки бальзама, следуя представленным процедурам разрезания и окрашивания, прежде чем можно будет подготовить все виды образцов различных размеров и форм, а также используя специальные держатели для создания цифровых изображений основных поверхностей для анализа сосудов. Сначала разрежьте плоскость поверхности ядра с помощью микротома ядра, как показано только что на рисунке, и с помощью фломастера окрасьте полученную поверхность в черный цвет.

Как только краситель высохнет, натрите поверхность ядра белым мелом, а затем вдавите мел в ячейки пальцем. Удалите излишки мела, а затем поместите ядро на столик бинокулярного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, начиная с одной стороны ядра. Теперь получите последовательность слегка перекрывающихся изображений, пока не будет захвачена вся поверхность.

Затем сшейте отдельные изображения вместе, чтобы создать полное изображение поверхности ядра и создать цифровые изображения из микрослайдов. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и выберите подходящее увеличение для анализируемых структур. Наконец, получите перекрывающиеся изображения сечений, установленных на очищенных микропредметных стеклах, как только что было показано для образца поверхности ядра, и соедините изображения вместе, чтобы создать одно полное изображение сечения.

Возможность иметь открытые клетки является первым важным шагом на пути к адаптации анатомических дендроэкологических структур к анализу временных рядов. Для более детального анализа ранней древесины или поздней древесины в хвойных породах здесь необходимы высококачественные микросрезы. Необходимо избегать потенциальных артефактов, таких как разрушенные клеточные стенки.

Применение к образцу неньютоновской жидкости, такой как раствор кукурузного крахмала, как только что было продемонстрировано, поддерживает стабильность клеточной структуры. Микроразделы позволяют более безопасно определять годовые ранги. Особенно это касается хвойных пород, растущих на своих естественных пределах.

Как видно на рисунке, чрезвычайно узкие кольца встречаются часто, но их трудно обнаружить макроскопически. В крайнем случае, кольца состоят из одного или двух рядов ячеек, которые могут быть видны только при использовании микросекций. При анализе изображений при большом увеличении видны отдельные клетки.

Полуавтоматическое программное обеспечение для анализа позволяет определять изменения отдельных параметров, таких как толщина клеточной стенки, для всех колец, видимых на изображении, что указывает на необходимость расширенного анализа временных рядов. Двойное окрашивание микросрезов позволяет визуализировать различные стадии одревеснения. Затем эта информация может быть соотнесена с экологическими данными соответствующего вегетационного периода для определения более подробной взаимосвязи роста климата после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области экологии ОРС к изучению различных анатомических параметров деревьев и кустарников. Использование этого метода значительно сокращает время, необходимое для изготовления больших и высококачественных секций. Во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа под вытяжным шкафом и ношение перчаток.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генерировать хорошо реплицированные наборы анатомических данных с высоким разрешением для поддержки анализа временных рядов.