Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в Saccharomyces Cerevisiae

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать дрожжевые клетки для поиска биологических процессов, на которые нацелено представляющее интерес химическое вещество. Это достигается путем предварительного определения профиля реакции на дозу химического вещества для дрожжей. Второй шаг заключается в выращивании полной коллекции штаммов с нокаутом гена дрожжей в сублетальной дозе химического вещества и на контрольной пластине.

Далее выявляются мутанты дрожжей, которые обладают гиперчувствительностью к химическому веществу. Этот список подвергается биоинформатическому анализу, чтобы выявить все гены, необходимые для переносимости химического вещества. Заключительным этапом является проведение биологической репликации эксперимента с низкой пропускной способностью.

Это подтверждает любые обнаруженные химические взаимодействия генов. В конечном счете, этот высокопроизводительный метод химико-генетического скрининга используется для того, чтобы показать, какие продукты генов и биологические пути используются для переносимости интересующего химического вещества. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как конкурентное выращивание мутантов со штрих-кодом в жидкой культуре, заключается в том, что не требуются методы молекулярной биологии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химической биологии, например, как новая маленькая молекула может ингибировать рост эукариотических клеток. Для начала приготовьте ночную культуру дрожжей, вычеркнув клетки BY 4 7 4 1 на планшете A-Y-E-P-D и инкубируйте в течение 48 часов при температуре 30 градусов Цельсия или до тех пор, пока не сформируются видимые колонии. Когда колонии будут готовы.

Приготовьте жидкие культуры на ночь, выбрав одну колонию и введя пять миллилитров жидкой среды YEPD в стерильный сосуд. Затем инкубировать в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия при непрерывном вращении или встряхивании. Далее готовят твердую агаровую среду, содержащую различные дозы испытуемого химического вещества.

Для этого нужно. Во-первых, приготовьте несколько исходных растворов исследуемого химического вещества в 100 раз выше конечной концентрации в соответствующем растворителе. Затем для каждой концентрации необходимо проверить аликвоту трех миллилитров расплавленного YEPD агара в несколько стерильных культуральных пробирок.

Поместите трубки с агаром в водяную баню при температуре 55 градусов Цельсия, чтобы предотвратить затвердевание агара. Теперь, для каждой концентрации химического вещества, которая должна быть испытана при 13, высвобождение белого соединения 100 x в аликвоту расплавленного агарового текса, пробирку в течение двух-трех секунд перемешать, а затем дозировать по одному миллилитру из каждой пробирки в дублирующие лунки в 12-мировую пластину, дать планшету застыть на ночь при комнатной температуре. На следующий день инокулируйте 10 миллилитров жидкой среды YEPD двумя микролитрами насыщенной на ночь дрожжевой культуры.

Затем пипеткой нанесите 25 микролитров этой культуры на химический агар, содержащий в лунки 12 китовой пластины и равномерно распределите с помощью стерильных стеклянных бусин или стерильного стержня. Дайте пластине высохнуть под огнем, а затем выдержите пластину при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов. По истечении времени инкубации оцените общее количество и размер колоний в лунках.

Определите сублетальную концентрацию соединения, которая не подавляет рост более чем на 10-15% для использования в скрининге. Поддерживайте скорость делеционных мутантных соединений на уровне плотности 384 колонии на пластину путем репликации на 16 агаровых пластинах YEPD, содержащих 200 микролитров на миллилитр G four 18. Использование роботизированной системы для микробной сборки или ручных инструментов для закрепления каждые три месяца.

Храните тарелки при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не потребуется. Затем приготовьте 250 миллилитров агаровых сред YEPD с одинаковой концентрацией G на четырех 18 или пяти агаровых пластинах, и оставьте их остывать на ночь при комнатной температуре на ровной ровной поверхности. Извлеките планшеты, содержащие коллекцию делеционного мутанта, из хранилища при температуре четыре градуса Цельсия и дайте планшетам нагреться до комнатной температуры.

Используйте деликатную салфетку, чтобы удалить конденсат, образовавшийся на крышке каждой пластины, чтобы предотвратить попадание капель воды на массив и перекрестное загрязнение мутантов массива. Пусть робот для закрепления микробной матрицы конденсирует делеционную мутантную матрицу с плотности 384 колоний на пластину на 16 чашках Петри до 1 536 колоний на пластину на четырех чашках Петри. После инкубации матрицы при 30 градусах Цельсия в течение ночи осмотрите матрицу, чтобы убедиться в равномерном переносе колоний с исходных пластин.

В массив будет включено несколько пустых позиций, которые послужат ориентиром для того, чтобы мутантный массив делеции был правильно сконденсирован. Это будут исходные пластины, используемые для репликации на носители, содержащие интересующее вас соединение. Одна исходная пластина может использоваться для нескольких штифтов.

Кроме того, многие роботы имеют функции смещения, которые позволяют, что обеспечит одинаковое количество дрожжей, переносимых каждый раз. Для организации восстановления мутантной матрицы реплики пластины используется 700 миллилитров контрольного только транспортного средства и экспериментального агара YEPD, содержащего интересующее химическое вещество. Этого достаточно для проведения анализа в трех экземплярах.

Заливаем пластины с помощью контрольного и экспериментального агара. Добавляем по 50 миллилитров в каждую тарелку. Дайте пластинам остыть при комнатной температуре в течение ночи на ровной ровной поверхности, используя робота для перекладки тарелки.

Инокулируйте двойную мутантную матрицу на три комплекта пластин, содержащих химические вещества, в экспериментально определенной концентрации, а также на сбросы пластин, содержащих управление транспортным средством. Инкубируйте планшеты на столе при комнатной температуре в общей сложности от 24 до 48 часов. Планшеты выдерживаются в течение 24 и 48 часов, снимая крышку и помещая их лицевой стороной вниз на планшетный сканер.

Снимайте изображения с разрешением не менее 300 точек на дюйм. В качестве альтернативы можно использовать цифровую камеру для съемки изображений. В этом случае положите тарелки лицевой стороной вверх на темный фон и снимите крышки для изображения.

Затем выполните количественную оценку и сравнение размеров колоний массива с помощью одной из нескольких программ с открытым исходным кодом, включая шаровые инструменты SGA и просеивающую мельницу. На этом этапе несколько мутантов делеции дрожжей будут оценены как гиперчувствительные к интересующему химическому веществу и выведут желаемые гиперчувствительные мутанты из коллекции делеции дрожжей на YEPD. Ager, содержащий 200 микрограмм на микролитр G, 18 инкубируют при 30 градусах Цельсия до образования колоний.

После верификации генотипа штамма методом диагностической ПЦР и электрофореза Агеля вводят по пять миллилитров жидкости YPD с каждым штаммом и инкубируют в течение ночи при 30 градусах Цельсия с вращением или встряхиванием. Измерьте наружный диаметр 600 для каждой культуры и разбавьте каждый сорт до наружного диаметра 600 для одного в стерильной дистиллированной воде. В настоящее время это нормализованные дрожжевые культуры.

Затем дозируйте 100 микролитров нормализованного дикого типа по 4 7 4 1 культуре дрожжей в лунку А один из 96 лунок планшет диспенсируйте 100 микролитров до семи дополнительных штаммов в лунки В один к Н одному. Затем налейте 90 микролитров стерильной воды в лунки, от А 2 до Н 2 до 6 до Н 6. Наконец, приготовьте серию от одного до 10 разбавлений нормализованных G-скульптур.

Начните с последовательного пипетирования 10 микролитров колонки 1 на колонку 2 с помощью многоканальной пипетки и продолжайте по 96-луночному планшету до тех пор, пока не будет произведено шесть разведений. Затем с помощью многоканальной пипетки нанесите от двух до пяти микролитров разведенных дрожжевых культур в сетку на YEP D's, твердых средах, содержащих химические вещества и средства контроля. Инкубируйте планшеты при соответствующей температуре в течение 24–48 часов после инкубации.

Осмотрите планшеты и сравните чувствительность выбранных мутантов к химическим веществам относительно контрольных видеопластин BY 47 41 через 24 и 48 часов. Как и ранее, на следующих изображениях представлены результаты процедуры определения субингибирующей концентрации химического вещества. На первом изображении показан рост насыщенной культуры BY 4 7 4 1 разбавленной от одного до 5 000 и покрытой на возрастающей концентрации пяти фторурацилом.

Концентрация 10 микромоляров выбрана в качестве субингибирующей дозы. На этом изображении показана кривая роста клеток BY 4, 7, 41 в жидких средах, содержащих пять флуроурацилов. Примерно в четырех случаях от 10 до 4 клеток осаждали в трех и возрастающих концентрациях пяти фторурацилов, а оптические плотности измеряли каждые 10 минут в течение 22 часов.

Опять же, можно видеть, что 10 микромолярная доза является субиночной ингибиторной дозой. На следующих изображениях показаны результаты химической генетики зеленого цвета пяти фторурацилов. Здесь показана мутантная матрица делеции S. sachar visier, реплицированная на агаре YPD, содержащем 10 микромолярных пяти фторуракулов справа и контроль ДМСО слева.

На этом графике показаны результаты химической генетики зеленого цвета, относительный рост мутантов на 10 микромолярах. Пять фторурацилов по сравнению с контролем ДМСО здесь упорядочены по положению луча. Относительный рост мутантов на 10 микромолярах, пяти флорах урацила по сравнению с контролем ДМСО упорядочен по соотношению размеров колоний.

На обоих графиках указано пороговое значение коэффициента менее 0,8. На этом последнем изображении показаны результаты трех валидационных анализов. Серийные разведения нескольких выделенных мутантных штаммов выращивали на контроле ДМСО слева, 10 микромоляров, пяти фторсодержащих UIL в центре и 0,015% метилметансульфоната справа.

При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что вы работаете с надежной копией делеционного мутантного массива, а также для проверки любых результатов с использованием независимой методологии, такой как анализ на дрожжевую пятнистость или вскрытие тетрады дрожжей. Этот метод предоставляет ученым в области исследований малых молекул эффективные средства для изучения механизма действия соединения с использованием системных подходов в почковающихся дрожжах.