Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

Здравствуйте, меня зовут Хелен Кастер, и я работаю в группе сердечно-сосудистых исследований доктора Гарольда и профессора в Университете Auto Vica в MacBook. Мы заинтересованы в определении характеристик изоляции морских моноцитов для использования в транспортных средствах при выращивании сопутствующих судов. Следующие основные этапы необходимы для культивирования моноцитов, полученных из костного мозга, первого мышиного обезболивания и вывиха шейки матки, второго удаления и промывания бедренной кости.

Третье фильтрование костного мозга. Четвертая – этапы промывки со средним, пятая, культивирование клеток на пластинах со сверхнизким прикреплением. Шестая проточная цитометрия.

Чтобы извлечь моноциты из костного мозга, мышь обезболивают фтором ISO и усыпляют при вывихе шейки матки. Мышь будет зафиксирована и обе нижние конечности разделены стероидным скальпелем. Бедренная и большеберцовая кости были собраны и промыты 96% этанолом в течение как минимум 90 секунд.

После этого все этапы должны быть строго стерильными, чтобы избежать загрязнения. Мышцы или сухожилия будут удалены из кости. Бедренную и большеберцовую кости несколько раз промывают теплой ПБС.

Для забора костного мозга проксимальный и дистальный концы каждой кости разрезаются тонкими ножницами. Для того, чтобы промыть кость, нам понадобится одна игла стероида 28 G, один миллилитровый шприц и от 10 до 15 миллилитров среды на кость. После этого костный мозг фильтруется через 70 микрометров S, удерживая кость тонкими щипцами.

Промывайте кости одну за другой, пока они не превратятся в иллюзию. Для того чтобы свести к минимуму напряжение клеток, осторожно надавите на штамп шприца. Промойте сиет с помощью PBS.

После этого клетки центрифугируют при 250 G в течение 10 минут при комнатной температуре. И являются ли реусы суспензированными со средними? После этого шага повторите его еще раз.

Для моноцитов, полученных из нативного костного мозга, мы используем М 199 с 1% пенициллина и стрептомицина и 10% фетальной сыворотки от кашля. Кроме того, мы добавляем 20 нанограмм на миллилитр INE MCSF в первый день. Восемь нанограммов на миллилитр интерфера гамма добавляются в последний день культивирования в среду.

Если требуется две апрегуляции MHC, ячейки засеваются в пластины со сверхнизким уровнем крепления и толстыми лунками для предотвращения постоянной адгезии к дну. Мы используем концентрацию от 10 до шести клеток на миллилитр, до шести миллилитров на лунку. Период выращивания составляет пять дней при температуре 37 градусов и 5% углекислого газа.

Клетки проверяются ежедневно, через пять дней от 60 до 80% клеток являются моноцитами. Меня зовут Мартин Бахнер, и я студент-медик здесь, в Университете Auto Fungi, на кафедре кардиологии, анологии и хронологии. И когда вы делаете внутривенную инъекцию, важно много практиковаться перед тем, как сделать это, потому что в противном случае вы не сможете адекватно применять моноциты.

Эксперименты показали, что моноциты наиболее эффективны в улучшении арт-агенезии при системном применении. Распространенным способом системного применения препарата является инъекция хвостовой ВА. В нашем случае мы вводим 2,5 миллиона моноцитов, которые представляют собой ресуспендию и хлорид натрия.

В хвосте мышиных артерий на вентральной и дорсальной стороне есть четыре сосуда, а на боковой стороне — два обзола. Таким образом, для впрыска WA нам приходится поворачивать хвост примерно на 90 градусов. Для облегчения процедуры мышь следует согревать с помощью грелки в течение примерно 10 минут.

За животными следует наблюдать путем утепления. Это важно для распознавания признаков перегрева. Кроме того, нам нужен этот возбудитель инфекции и набор игл 30 генов на одном миллилитровом инсулиновом шприце

Зафиксируйте животное аккуратно в удерживающем устройстве, что значительно облегчает его впрыскивание в хвостовой ход. Перед загрузкой раствора в шприц убедитесь, что у мыши достаточно места для дыхания. Vortex, раствор моноцитов, чтобы убедиться, что все моноциты могут быть введены введено.

Дезинфицирует место укола, чтобы избежать инфицирования, возьмите хвост между ударом и указательным пальцем. В самой дистальной точке игла вводится под плоским углом. Если он помещен в вену, то очень легко ввести раствор моноцита.

Если есть волдырь, это признак неправильной инъекции. Вы должны немедленно остановиться и попробовать еще. Проксимально, всегда старайтесь вводить медленно и не более пяти микролитров на грамм.

Если инъекция прошла успешно, остановите кровотечение в месте инъекции, слегка надавливая на нее в течение примерно одной минуты. В конце процедуры откройте ретрактор и поместите мышь в его клетку, чтобы охарактеризовать моноциты. Мы используем эффекты с комбинацией антигенов, а именно CD 11 B, F four 80, CD 115 и GL one.

Экспрессия этих антигенов коррелирует со стадией развития для анализа моноцитов. Мы проверили факты на 0, 3, 5 и 7 день, чистота моноцитов увеличивается до 90% на пятый день. Чтобы достичь этой чистоты, важно сильно истощить терриновые макрофаги.

Нетерриновые клетки истощаются при использовании буфера для промывки, не содержащего ЭДТА. Чтобы истощить терриновые клетки, мы используем ЭДТА, содержащую средство для мытья, буфер и нежное поглаживание. На этой диаграмме показаны основные типы клеток для их одноконечной культуры.

Показаны различные типы клеток: один лимфоцит, два моноцита, три гранулоцита, повышающие чистоту моноцитов после пятого дня. И культура. Следует отметить, что изменяющийся клеточный состав во время культивирования клеточной популяции включает в себя один моноцит и два макрофага.

Рисунок второй: временная шкала экспрессии CD 115 во время дифференцировки. Обратите внимание, что более 95% всех клеток являются CD-115-положительными после пяти дней дифференцировки, что указывает на то, что подавляющее большинство клеток являются либо моноцитами, либо макрофагами. Классификация может быть основана на размере и зернистости клеток, но конкретные клеточные маркеры более надежны.

Рисунок третий, повышение экспрессии зрелости моноцитарных макрофагов. Маркер F four 80, день пятый, отмечают появление популяции с промежуточной экспрессией F four 80, что согласуется с фенотипом моноцитов. На седьмой день обратите внимание на сдвиг экспрессии F 4 80 вправо, соответствующий созреванию макрофагов.

Выделение моноцитов имеет важное значение для многих исследований in vitro и in vivo. Эти клетки являются интересной мишенью, например, в связи с такими заболеваниями, как болезнь периферических артерий или ишемическая болезнь сердца, которые связаны с ишемией. Костный мозг из FEMA и большеберцовой костей биопсийных мышей собирают путем промывания костей теплой суспензией клеток среды, добавляют MCSF и культивируют на поверхностях со сверхнизким прикреплением, чтобы избежать адгезии, вызывают дифференцировку моноцитов, свойства и дифференцировку моноцитов проверяют в разное время, а для фенотипирования клеток используют такие маркеры, как CD 11 b, CD 115 и FO 80.

Если требуется системная доставка лекарств, внутривенная инъекция является простым и эффективным способом сделать это. Мы описали метод выделения большого количества моноцитов ИМ из костного мозга простым и экономически эффективным способом. С помощью этого нового метода мы можем генерировать около 11 миллионов моноцитов на одну мышь.