Методов оценки цитотоксичности и подавления иммунитета горючих Табачные компонентов Продукт

Общая цель этой процедуры заключается в оценке влияния препарата табачного изделия на секрецию цитокинов и уничтожение клеток-мишеней P BMC. Это достигается путем первичной обработки культивируемых P BMC состоянием цельного дыма, среды или никотина, а затем выполняется внутриклеточное окрашивание обработанных p-BMC для определения их продукции цитокинов. В альтернативном варианте меченые CFSE клетки K 5 62 подвергаются совместному культивированию с эффекторными клетками PBMC, обработанной цельной дымовой средой, и жизнеспособность клеток K 5 62 квалифицирована путем окрашивания на семь A d.

В конечном счете, влияние горючих препаратов табачных изделий на P BMC из любого анализа измеряется с помощью проточной цитометрии. Основными преимуществами наших методов или существующих методов, таких как анализ высвобождения хрома или пятно ALI, являются наши методы высокой пропускной способностью, нерадиоактивностью, и мы можем измерить функциональность клетки. Тем не менее, этот метод может дать представление о биологических эффектах препаратов табачных изделий.

Он также может быть применен для оценки других соединений, которые влияют на функции, опосредованные to-подобными рецепторами, и STIC эффекторных клеток PBMC перед началом процедуры окрашивания. Разбавляют цельный дым, среду и никотин в перечисленных концентрациях. В RPMI полная среда до общего объема 100 мкл на лунку в 96-луночном планшете.

Затем добавьте 100 микролитров P BMC, взвешенных в полной среде в концентрации один умножить на 10, на шесть ячеек на лунку из расчета 200 микролитров на лунку. Далее накройте тарелку крышкой и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Через три часа промойте клетки и аспирируйте надосадочную жидкость.

Затем снова накройте пластину крышкой и сделайте в ней вихревые движения, чтобы диссоциировать гранулы. Промойте ячейки еще два раза, один раз в ледяном проточном буфере, и один раз в полной среде после второй промывки. Обрабатывайте их 200 микролитрами на лунку полной среды с добавлением пробки Гольджи и ЛПС в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Затем промойте клетки ледяным проточным буфером и обработайте их 100 микролитрами цитофикса на лунку при температуре четыре градуса Цельсия через 20 минут, трижды промойте клетки ледяной химической завивкой. Затем добавьте в каждую лунку по 45 микролитров цитохимической завивки, а затем по пять микролитров каждого из перечисленных антител. Через 30 минут при четырех градусах Цельсия трижды промыть клетки и зафиксировать их в 200 микролитрах ледяного льда, 2% параформальдегида.

Затем перенесите клетки в пробирки размером 12 на 75 миллиметров и проанализируйте образцы на проточном цитометре. После приготовления тарелки с табачным изделием, обработанным pbmc, как только что продемонстрировано, промойте культуру из K 5 62 клеток, собранных при 80%-ной плавности в 10 миллилитрах DPBS. Ресус. Суспензируйте гранулу в пяти миллилитрах DPBS и подсчитайте ячейки.

Затем добавьте один миллилитр свежеприготовленного рабочего раствора CFSE в один-два раза по 10 до седьмой К 5 62 клеток в один миллилитр готовой среды и диспергируйте клеточное окрашивание путем вортексирования. Инкубируйте клетки при комнатной температуре ровно через две минуты, добавьте 200 микролитров FBS и снова переведите клетки в вихрь, инкубируя их еще две минуты. После второй инкубации промойте клетки в 10 миллилитрах полной среды, затем повторно суспендируйте гранулу еще в 10 миллилитрах полной среды и подсчитайте ячейки.

Теперь центрифугируйте обработанный табак p BMC и сцедите надосадочную жидкость. Затем установите крышку на место, повторно суспензируйте клетки методом вортекса и промойте их в 200 микролитрах готовой среды на лунку. Чтобы начать анализ на убийство, добавьте меченые CFSE клетки K 5 62 в pbmc в соотношении один к 15 и инкубируйте кокультуру при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Через пять часов раскрутите клетки вниз и выбросьте надосадочную жидкость. Суспензируйте гранулы путем вортексирования, а затем промойте ячейки 200 микролитрами проточного буфера на лунку, затем добавьте 95 микролитров проточного буфера, а затем пять микролитров по семь А и д, чтобы получить общий объем 100 микролитров на лунку. Наконец, инкубируйте клетки в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.

Затем добавьте по 100 микролитров проточного буфера в каждую лунку и переведите весь объем на соответствующие факсимильные трубки, чтобы определить процентное соотношение семи a a D и CFSE положительных ячеек. По данным проточного цитометрического анализа, дозозависимое увеличение гибели клеток наблюдается при использовании цельной дымовой кондиционированной среды в течение 24 часов, при этом почти 80% клеток погибают при четырех микрограммах на миллилитр лошадиных никотиновых единиц. Тем не менее, обработка p BMC в течение всего лишь трех часов не приводит к значительной токсичности даже при концентрации пяти микрограммов на миллилитр лошадиных никотиновых единиц цельной дымовой кондиционированной среды в течение 24 часов.

Сопоставимая степень гибели клеток не отмечается до обработки 3000 микрограммами на миллилитр никотина через три часа, лечение никотином не вызывает измеримой гибели клеток до обработки концентрацией 2000 микрограмм на миллилитр с использованием цельного дыма, среды и никотина, с последующей стимуляцией четвертого рецептора TLR с помощью ЛПС, что приводит к дозозависимому снижению секретируемых цитокинов. Хотя степень подавления варьируется у разных цитокинов. Кроме того, при обработке клеток ЛПС и пробкой Гольджи в течение всего лишь шести часов, после воздействия цельной дымовой среды наблюдается снижение количества внутриклеточных цитокин-положительных клеток, даже при более низких концентрациях лошадиных никотиновых единиц по сравнению с воздействием никотина.

Действительно, результаты этого анализа убийства показывают, что воздействие 1,56 микрограмма на миллилитр цельной дымовой среды значительно снижает убивающую способность эффекторной популяции PBMC по сравнению с контролем и более низкими концентрациями дозы. Принимая во внимание, что лечение никотином в высоких или низких концентрациях не влияет на убивающую способность эффекторной популяции PBMC при попытках проведения этих процедур. Важно быть точным в отношении маркировки CFSE, а также разведения антител, времени мечения и температуры инкубации.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как использовать методы мечения антителами в проточной цитометрии для определения влияния препаратов табачных изделий или других методов лечения на мононуклеарные клетки периферической крови.