Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать, как синаптические связи между морфологически идентифицированными нейронами характеризуются как функционально, так и структурно. Это достигается за счет получения острых срезов мозга, которые оптимизированы для изучения той или иной синаптической связи. Затем зажатие патча используется для проверки синаптически связанных нейронов.

Для этого отдельный проспективный постсинаптический нейрон патчируется, а вторая пипетка затем используется для стимуляции окружающих нейронов, чтобы установить существование синаптической связи. Если реакция не видна, стимулирующий электрод перемещается. Как только связь найдена, пресинаптический нейрон повторно сопоставляется в оптовом режиме.

После электрофизиологических записей с этих нейронов и одновременного наполнения биотином срез фиксируется, обрабатывается для биотина и выполняется компьютерная 3D-реконструкция нейронов. В конечном счете, наш метод направлен на коррелированный количественный структурный и функциональный анализ нейронных микросхем. Основное преимущество парных записей от синаптически связанных нейронов заключается в том, что мы можем выполнить коррелированный структурный и функциональный анализ как пре, так и постсинаптических нейронов в нейронных микросхемах.

Даже в последнее время внедренные методы, такие как оптическая стимуляция нейронов, пока не в состоянии достичь этого с такой степенью детализации. Этот метод позволяет изучать взаимодействие возбуждения и торможения морфологически идентифицированных типов нейронов и то, как модулируется их активность. Демонстрировать процедуры записи домашних животных будет Гуань.

Тот, кто является постдоком в моей лаборатории. Подготовив срезы целевой области, дайте им за это время инкубироваться, вытяните патч-пипетки, которые должны иметь длинную и тонкую хвостовицу. Закрепив срез мозга платиновой арфой в экспериментальной камере, наполните записывающую пипетку внутренним раствором.

Поместите пипетку в предусилитель и заплатите предполагаемый постсинаптический нейрон в режиме всей клетки с помощью поисковой патч-пипетки сопротивления от 8 до 10 мегаом, заполненной внутренним раствором, в котором соли калия заменены солями натрия. Мягко отсосите пипетку, чтобы запачкать потенциальный пресинаптический нейрон в свободной клетке. Прилагаемая конфигурация.

Удерживайте потенциал мембраны под ослабленным уплотнением в диапазоне от отрицательных 30 до отрицательных 60 милливольт в режиме зажима тока. Затем подайте большие импульсы тока от 0,2 до двух наноампер, чтобы вызвать потенциал действия в потенциальной пресинаптической ячейке. Наблюдайте за этим потенциалом действия в виде небольшого колоска на характеристике напряжения.

Установите частоту стимуляции на 0,1 герц, чтобы предотвратить истощение постсинаптического ответа. Если постсинаптический нейрон не реагирует на стимуляцию испытуемого потенциально пресинаптического участка нейрона, то новый потенциальный пресинаптический нейрон находится в режиме ослабленного уплотнения. Таким образом протестируйте до 30 потенциально пресинаптических нейронов.

Продолжайте использовать один и тот же поисковый патч-электрод до тех пор, пока не будет установлено уплотнение с сопротивлением более 30 мегаом. Если стимуляция в режиме свободного уплотнения приводит к EPSP или IPSP с задержкой менее пяти миллисекунд в постсинаптическом нейроне, удалите ищущую пипетку из пресинаптического нейрона с помощью записывающего электрода, заполненного биотином, содержащим обычный внутренний раствор с сопротивлением от четырех до восьми мегаом. Заплатите за пресинаптический нейрон и запишите во всю клетку режим зажима тока.

Вызывайте потенциалы действия путем инжекции тока в пресинаптические нейроны и регистрируйте постсинаптический ответ. Сохраните данные на компьютере для последующего анализа в автономном режиме. На протяжении всей записи биотин диффундирует в нейрон для получения адекватного окрашивания.

Дайте биотину диффундировать в течение как минимум 15-30 минут в зависимости от размера нейрона. Для нейронных микросхем с высоким коэффициентом связности поисковый электрод не используется. Лучше начать с непосредственного подключения пресинаптического нейрона в режиме всей клетки.

Затем с помощью патч-электрода, заполненного обычным внутренним раствором, потенциальный постсинаптический нейрон также в режиме всей клетки, обе клетки должны находиться под текущим контролем зажима. Выявлять потенциал действия в пресинаптической клетке и контролировать предполагаемый постсинаптический нейрон на предмет постсинаптического потенциала. Если нейрон не проявляет реакции на пресинаптическую стимуляцию, используйте новый электрод, чтобы снова подключить новый нейрон в режиме всей клетки.

Когда соединение будет найдено, продолжайте запись, как показано ранее, не меняя патч-пипетку. После фиксации и монтажа срезов, как описано в текстовом протоколе, исследуйте помеченные биотином нейроны под световым микроскопом. Убедитесь, что аксональные палочки и дендритные шипы хорошо видны.

Используя коммерческую систему отслеживания нейронов, вручную отслеживайте нейроны или синаптически связанные пары нейронов. Обязательно включайте даже небольшие аксональные или дендритные коллатерали. Используйте трассы для получения 3D нейронных реконструкций, корректируйте нейронные реконструкции на усадку во всех трех пространственных измерениях в соответствующем разделе программы трассировки.

Поправочные коэффициенты на усадку для закладной среды составляют приблизительно 1,1 для направлений x и y и примерно 2,1 для направления Z. Взаимно связанная клеточная пара, состоящая из колючего звездчатого и быстро переходящего в него нейрона. В корковом слое четыре были заполнены биотином.

Во время записи зеленые точки указывают на предполагаемые возбуждающие синаптические синаптические контакты между пресинаптическим шиповидным нейроном и постсинаптическим интернейроном. Синие точки указывают на предполагаемые реципрокные тормозящие синаптические контакты. Здесь показаны изображения синаптических контактов с высокой мощностью.

Зеленые открытые круги показывают возбуждающие контакты, а синие открытые круги показывают тормозящие контакты. Здесь показана нейропросветленная реконструкция этой взаимно связанной пары клеток. Аксон интернейронов показан синим цветом, а его сома и дендрит — красным

Аксон колючих нейронов показан зеленым цветом, а его сома и дит — белым. На врезке показаны сомато-дендритные компартменты пре- и постсинаптических нейронов. Вместе с предполагаемыми синаптическими контактами контуры бочек были идентифицированы на маломощных светлопольных фотомикрофотографиях, сделанных из острого среза мозга.

Здесь показано репрезентативное синаптическое соединение с очень низким коэффициентом связности. Пресинаптический потенциал действия в клетке параметалла шестого слоя вызывал моносинаптический возбуждающий постсинаптический потенциал в звездчатом параметаллическом нейроне четвертого слоя. Показанная здесь задержка более трех миллисекунд этого трансламинарного соединения намного длиннее, чем задержка примерно в одну миллисекунду, наблюдаемая при локальных интраламинарных соединениях.

Два потенциала действия с частотой 10 Гц, вызванные в параметаллической клетке шестого слоя, запускали постсинаптические потенциалы в звездчатом параметаллическом нейроне четвертого слоя, показанном здесь. Обратите внимание на краткосрочную фасилитацию. Важно помнить, что условие слэшинга должно быть оптимизировано для данного синаптического соединения, и что во время записи настройка должна быть абсолютно стабильной, и тогда будет гарантировано оптимальное понимание записи.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как используются электрофизиологические измерения и морфологические реконструкции для получения общей картины структурных и функциональных свойств нейронных микросхем в неокортексе.