Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны

Цель этой процедуры состоит в том, чтобы точно измерить влияние, которое клостридиальные нейротоксины оказывают на синаптическую передачу в сетевых культурах нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши. Это достигается путем предварительной адаптации эмбриональных стволовых клеток к питающей бесклеточной суспензионной культуре и поддержания адаптированных клеток в плюрипотентном состоянии. Второй шаг заключается в дифференцировке адаптированных к суспензии стволовых клеток в нейроны или ESN с использованием вариации метода дифференцировки четырех четырех.

Затем ESN обрабатываются рядом сред, способствующих созреванию в синаптически активные сетевые нейроны. Заключительным этапом является лечение ЭСН клостридиальными, нейротоксинами или другими нейротоксинами и измерение влияния на моносинаптическую активность с помощью электрофизиологии с использованием зажима для всего клеточного пластыря. В конечном счете, изменения в спонтанном производстве моносинаптической активности количественно оцениваются по электрофизиологическим записям, нормализованным по возрасту и количеству контрольных нейронов, и сравниваются между различными условиями, такими как дозы, время или медикаментозное лечение.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что ЭСН являются первой клеточной моделью, которая воспроизводит функциональные патологии, ответственные за клинические проявления ботулизма и столбняка. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что ЭСН очень восприимчивы ко всем клостридиальным нейротоксинам, основанным на расщеплении белка малого барабана, а также демонстрируют спонтанную синаптическую активность в эмерджентном сетевом поведении. Демонстрировать процедуру будет г-жа Меган Лайман, техник из моей лаборатории Begin, путем переноса питательной бесклеточной суспензионной культуры, адаптированной для этого.

ESC агрегатируется в коническую трубку объемом 15 миллилитров и позволяет заполнителям осесть в компактную гранулу. Как только агрегаты осядут, аспирируйте натант SUP, стараясь при этом не нарушить клеточную гранулу. Затем добавьте пять миллилитров PBS для промывания клеток и центрифугируйте при 100-кратном G в течение 2,5 минут.

Осторожно отсадите PBS, а затем добавьте 500 микролитров трипсина и несколько раз переверните трубку, чтобы мягко разрушить клеточную гранулу. Затем поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и выдерживайте в течение трех минут. По истечении времени инкубации верните пробирку в колпак для культуры тканей и добавьте 500 микролитров среды ESC для разбавления трипсина.

Затем итрируйте суспензию CEL от пяти до 10 раз с помощью пипетки P 1000 для получения одноклеточной суспензии. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и центрифугируйте оставшуюся часть клеточной суспензии в 200 раз больше G в течение трех минут. После аспирации супината мы суспендируем клетки до конечной концентрации один цент, семь клеток на миллилитр со средой ESC.

Далее перелейте 150 микролитров суспензии в 10 миллилитров ESC среды в 10-сантиметровую бактериальную посуду и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. E ESC обычно проходят с использованием этого протокола. Каждые 48 часов дифференцировка ЭСК в нейроны начинается во время обычного прохождения клетки.

Диссоциируйте ЭСК, как и раньше, но включите дополнительную пластину для дифференцировки нейронов. Перелейте 350 микролитров клеточной суспензии в 10-сантиметровую чашку с низким прикреплением, содержащую 25 миллилитров дифференцировки. Терпимая. Поместите чашку на орбитальный шейкер со скоростью от 30 до 45 оборотов в минуту внутри инкубатора для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и инкубируйте в течение 48 часов.

Через 48 часов с помощью пипетки объемом 25 миллилитров перенесите агрегаты дифференцирующих клеток в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Сразу после добавьте 25 миллилитров свежей дифференциации. Средний до чашки Петри.

Дайте заполнителям осесть в течение двух-пяти минут, образуя видимую гранулу глубиной от одного до двух миллиметров. Осторожно отсасывайте среду, игнорируя отдельные клетки или небольшие агрегаты, все еще находящиеся во взвешенном состоянии, и с помощью пипетки P 1000 перенесите палитру клеток обратно в чашку Петри. Верните блюдо в вращающийся шейкер в инкубатор.

Через 48 часов повторите процедуру смены носителя. На этот раз на 30 миллилитров дифференцировочной среды с добавлением шести микромоляров всей транс-ретиноевой кислоты. Сформированная гранула теперь будет иметь глубину от двух до четырех миллиметров после инкубации клеток.

Как и раньше, повторите процедуру смены среды с добавкой ретиноевой кислоты в последний раз. На следующий день гранула будет иметь глубину от четырех до восьми миллиметров. Подготовьте поверхности для нанесения покрытия, как указано в письменной части протокола, во второй половине дня в день нанесения покрытия или по пять миллилитров предварительно покрытой среды трипсина MPC и 0,1% ингибитора триина сои при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем с помощью пипетки объемом 25 миллилитров можно перенести дифференцирующие агрегаты с культуральной пластины в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Дайте заполнителям осесть в течение трех-пяти минут, а затем осторожно отсадите среду, не нарушая гранулы. Далее промойте гранулу пятью-10 миллилитрами PBS и после того, как осядут заполнители.

Отсадите PBS и повторите промывку. После второй PBS промывки. Добавьте в гранулу пять миллилитров среды ПДК и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Осторожно щелкайте трубкой два-три раза во время инкубации. Далее добавьте в клетки пять миллилитров 0,1%-ного ингибитора трипсина сои и быстро перемешайте, инвертировав. Затем осторожно тритируйте клетки от 10 до 15 раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров до получения относительно однородной клеточной суспензии.

Медленно отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 или 70 микрон, помещенный поверх конической трубки объемом 50 миллилитров. Затем, как только вся суспензия будет отфильтрована по одному миллилитру N двух, в среду фильтр промыть оставшиеся клетки через ситечко. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте в течение шести минут при 200-кратном G. После аспирации среды, не нарушая температуру гранул, растирайте в двух миллилитрах N двух сред, затем добавьте N две среды до общего объема 10 миллилитров.

Центрифугируйте в течение пяти минут 200 раз. G. Отсадите среду и повторите процесс промывки гранул еще раз. Резус суспензируют в грануле по 10 миллилитров N двух сред.

Удалите аликвоту из клеток и подсчитайте с помощью гемоцитометра, а затем повторите центрифугирование по Ризу. Суспендируйте клетки в N двух средах до конечной концентрации от 1 до 10 до 7 клеток на миллилитр и нанесите на них плотность от 150 000 до 200 000 клеток на квадратный сантиметр. Indic готовят при DIV минус один и помещают в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия.

Поддерживайте ESN в соответствии с инструкциями в письменном протоколе. Сначала разведите ботулотоксин нейротоксина серотипа А до 100-кратной от желаемой конечной концентрации в культуре ЭСН, средней и теплой до 37 градусов Цельсия. Затем добавьте соответствующий объем токсина в DIV 21 плюс культуры ESN.

Набухните чашку для культуры и верните в инкубатор в нужное время. Точечно аспирируйте питательную среду ESN и дважды промойте внеклеточным записывающим буфером или ERB. Затем добавьте четыре миллилитра ЭРБ, дополненных пятью микромолярными тетродатоксинами для блокирования потенциалов действия и 10 микромолярными биколином для антагонизма активности рецепторов ГАМК.

Далее перенесите тарелку в электрофизиологическую установку. Для измерения ингибирования синаптической передачи или анализа тумана не требуется ни перфузия, ни контроль температуры. После использования микродозатора для извлечения босиликатных пипеток с сопротивлением от пяти до 10 мегаом, заполните пипетку внутриклеточным записывающим буфером.

Затем аккуратно окуните пипетку в кремниевый реагент. Закрепите записывающую пипетку на держателе электродов и прикрепите наполненный воздухом шприц к трубке, которая вставлена в держатель электрода. Обеспечьте постоянное положительное давление с помощью шприца, опуская записывающую пипетку в ERB.

После осторожно приземлите записывающую пипетку на СОР регистрируемого нейрона. Чтобы увидеть положительное давление, нарушите защитную пленку на шприце. Подсоедините шприц и надавливайте на постоянное отрицательное давление с помощью мягкого вдоха, чтобы сформировать гигаомное уплотнение.

Как только гига-оме уплотнение будет сформировано, уменьшите напряжение удержания до минус 70 милливольт. Затем осторожно подайте короткие импульсы отрицательного давления с помощью шприца, чтобы разбить всю конфигурацию клетки. Отслеживайте скачки емкости в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что патч стабилен.

Отмените скачки емкости в программном обеспечении HEA и переключитесь в режим токового зажима для мониторинга и записи потенциала мембраны покоя без регулировки потенциалов жидкостного перехода. Мембранный потенциал покоя может находиться в диапазоне от минус 67 до минус 82 милливольт. Отрегулируйте коэффициент усиления до двух милливольт на пикоусилитель.

Переключитесь в режим зажима напряжения и выполните непрерывную запись с напряжением минус 70 милливольт в течение трех-пяти минут, чтобы обнаружить миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи. Анализируйте от трех до пяти минут записанных данных для обнаружения ПСК с использованием стандартных настроек для EPC рецепторов AMPA в мини-анализе, собирайте и сохраняйте информацию об обнаруженных событиях. После сбора частот M-E-P-S-C от восьми до 12 контрольных и от восьми до 12 образцов ботулинического нейротоксина обрабатывали образцы для каждого условия воздействия.

Проанализируйте частоту в зависимости от возраста и контрольной группы, затем определите статистическую значимость процента ингибирования синаптической активности с помощью соответствующих статистических тестов с 7-го по 49-й разделы, ЭСН экспрессируют нейротропные компартменты и формируют синаптическую пунктуру. Таксодендритные интерфейсы. ЭСН подвергаются ингибированию синаптической активности при воздействии ботулотоксина нейротоксина серотипа А ТГ и столбнячного токсина.

Эти репрезентативные следы из ЭСН были собраны через 20 часов после принятия ванны с серотипами ботулинического нейротоксина, столбняком А ТГ, нейротоксином или носителем. Каждый нейротоксин снижал синаптическую активность более чем на 95% по сравнению с контрольной группой. Следующие четыре изображения показывают чувствительность использования тумана для измерения моносинаптической активности в серотипе ботулинического нейротоксина, обработанных ESN.

На этом первом изображении показаны репрезентативные следы пропущенных измерений синаптической активности через 20 часов после принятия ванны с дозой нейротоксина ботулотоксина серотипа А. В сегментах следа зажима напряжения наблюдалось снижение частоты M-E-P-S-C после воздействия нейротоксина ботулотоксина серотипа А. На этом изображении показана количественная оценка частоты M-E-P-S-C и подтверждается дозозависимое снижение частоты M-E-P-S-C. Медианную ингибиторную концентрацию определяли методом наименьших квадратов нелинейной регрессии с использованием четырехпараметрического переменного наклона. Обратите внимание, что предел обнаружения туманом в SNS составляет не менее 0,005 пикаМоляр.

На этой гистограмме показана цитометрическая количественность расщепления SNAP 25, измеренная с помощью вестерн-блоттинга. Обратите внимание на сниженную чувствительность расщепления белка малого барабана в качестве признака интоксикации. По сравнению с туманом, одна звездочка указывает на значение P менее 0,05.

Тройная звездочка указывает на значение P меньше 0,001. Эти результаты демонстрируют, что сетевые популяции нейронов, полученных из стволовых клеток, предлагают физиологически значимую клеточную модель отравления клостридиальными нейротоксинами. Ожидается, что использование SNS значительно снизит дистресс и смертность животных, выступая в качестве подходящей замены теста на летальность мышей с дополнительным преимуществом в виде улучшенной скоростной специфичности и чувствительности.

Этот метод открывает исследователям в области нейротоксикологии путь к использованию методов скрининга с умеренной пропускной способностью, основанных на активности нейронной сети, для облегчения терапевтического скрининга и обнаружения токсинов на клостридиальные нейротоксины.