Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны

Целью данной процедуры является точное измерение влияния нейротоксинов Clostridial на синаптическую передачу в сетевых культурах нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши. Это достигается путем предварительной адаптации эмбриональных стволовых клеток к суспензионной культуре без использования фидерных клеток и поддержания адаптированных клеток в плюрипотентном состоянии. Вторым этапом является дифференцировка адаптированных к суспензии стволовых клеток в нейроны или ESN с использованием модификации метода четырехэтапной дифференцировки.

Затем ESN обрабатывают серией сред для стимуляции их созревания в синаптически активные сетевые нейроны. Заключительным этапом является обработка ESN клостридиальными нейротоксинами или другими нейротоксинами с последующим измерением влияния на моносинаптическую активность с помощью электрофизиологического метода локальной фиксации потенциала (whole cell patch clamp). В конечном итоге изменения спонтанной моносинаптической активности количественно определяют на основе электрофизиологических записей, нормализованных относительно контрольных нейронов того же возраста и из той же партии, и сравнивают между различными условиями, такими как дозы, время воздействия или применение препаратов.

Основное преимущество данного метода заключается в том, что ESN являются первой клеточной моделью, воспроизводящей функциональные патологии, ответственные за клинические проявления ботулизма и столбняка. Идея этого метода возникла у нас после того, как мы обнаружили, что ESN обладают высокой чувствительностью ко всем нейротоксинам клостридий, воздействующим путем расщепления белков SNARE, а также демонстрируют спонтанную синаптическую активность в рамках формирующегося сетевого поведения. Процедуру продемонстрирует г-жа Меган Лайман, техник моей лаборатории. Начните с переноса адаптированной суспензионной культуры без фидерных клеток.

Перенесите агрегаты ESC в коническую пробирку объемом 15 мл и дайте им осесть в компактный осадок. После того как агрегаты осядут, аспирируйте супернатант, стараясь не повредить клеточный осадок. Затем добавьте 5 мл PBS для промывки клеток и центрифугируйте при 100 ×g в течение 2,5 минут.

Осторожно аспирируйте PBS, затем добавьте 500 µL трипсина и несколько раз переверните пробирку, чтобы аккуратно разрушить клеточный осадок. После этого поместите пробирку в водяную баню при 37 °C и инкубируйте в течение трех минут. По истечении времени инкубации верните пробирку в ламинарный шкаф для культивирования тканей и добавьте 500 µL среды для ESC, чтобы развести трипсин.

Затем тритуйте суспензию CEL от 5 до 10 раз с помощью пипетки P 1000 для получения суспензии одиночных клеток. Подсчитайте количество клеток в аликвоте с помощью гемоцитометра, а оставшуюся часть клеточной суспензии центрифугируйте при 200 ×g в течение трех минут. После аспирации супернатанта суспендируйте клетки в среде ESC до конечной концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл.

Затем перенесите 150 µL суспензии в 10 mL среды для ESC в бактериальную чашку диаметром 10 cm и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. ESC регулярно пассируют с использованием данного протокола. Каждые 48 часов в ходе рутинного пассирования клеток начинается дифференцировка ESC в нейроны.

Проведите диссоциацию ESC, как описано ранее, но используйте дополнительную планшетную среду для нейрональной дифференцировки. Перенесите 350 µL клеточной суспензии в 10 см чашку с низкой адгезией, содержащую 25 mL среды для дифференцировки. Поместите чашку на орбитальный шейкер, настроенный на 30–45 RPM, внутри инкубатора для культур тканей при 37 °C и 5% CO2 и инкубируйте в течение 48 часов.

Через 48 часов с помощью пипетки на 25 мл перенесите дифференцирующиеся клеточные агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Сразу после этого добавьте 25 мл свежей дифференцировочной среды в чашку Петри.

Дайте агрегатам осесть в течение двух-пяти минут до образования видимого осадка глубиной один-два миллиметра. Осторожно аспирируйте среду, не обращая внимания на отдельные клетки или мелкие агрегаты, остающиеся во взвеси, и с помощью пипетки P 1000 перенесите клеточный осадок обратно в чашку Петри. Поместите чашку на ротационный шейкер в инкубатор.

Спустя еще 48 часов повторите процедуру смены среды. На этот раз используйте 30 миллилитров дифференцировочной среды с добавлением six micromolar all trans retinoic acid. После инкубации клеток сформированный осадок будет иметь глубину от двух до четырех миллиметров.

Как и ранее, повторите процедуру замены среды с добавлением ретиноевой кислоты в последний раз. К следующему дню глубина осадка составит от четырех до восьми миллиметров. Во второй половине дня в день посева подготовьте поверхности для посева, как описано в текстовой части протокола, а также по 5 mL предварительно покрытой среды MPC с трипсином и 0,1% ингибитора трипсина из сои при 37 °C.

Затем с помощью пипетки на 25 мл перенесите дифференцирующиеся агрегаты из культуральной чашки в коническую пробирку объемом 50 мл. Дайте агрегатам осесть в течение трех-пяти минут, после чего осторожно аспирируйте среду, не задевая осадок. Затем промойте осадок 5–10 мл PBS и дождитесь оседания агрегатов.

Отососите PBS и повторите промывку. После второй промывки PBS добавьте пять миллилитров среды для MPC-изации к осадку и инкубируйте его при 37 °C в течение пяти минут.

Во время инкубации аккуратно постучите по пробирке два или три раза. Затем добавьте к клеткам 5 мл 0,1% соевого ингибитора трипсина и быстро перемешайте путем инверсии. После этого осторожно тритурируйте клетки 10–15 раз с помощью 10-миллилитровой пипетки до получения относительно гомогенной клеточной суспензии.

Медленно профильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 40 или 70 микрон, помещенный на коническую пробирку объемом 50 мл. После того как вся суспензия будет профильтрована, добавьте 1 мл среды N2 на фильтр, чтобы промыть оставшиеся клетки через сито. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение шести минут при 200 ×g. После аспирации среды, не затрагивая осадок, тритурируйте его в 2 мл среды N2, затем добавьте среду N2 до общего объема 10 мл.

Центрифугируйте в течение пяти минут при 200 ×g. Аспирируйте среду и повторите процесс промывки осадка. Ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах среды N2.

Возьмите аликвоту клеток и подсчитайте их с помощью гемоцитометра, затем повторите центрифугирование. Ресуспендируйте клетки в среде N2 до конечной концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл и высейте их с плотностью от 150 000 до 200 000 клеток/см². Подготовку проводят на этапе DIV -1, после чего посев помещают в инкубатор для культур тканей при 37 °C.

Поддерживайте ESN в соответствии с инструкциями, изложенными в письменном протоколе. Сначала разведите ботулотоксин серотипа A в культуре ESN до концентрации, в 100 раз превышающей желаемую конечную, и подогрейте до 37 °C. Затем добавьте соответствующий объем токсина в культуры DIV 21 плюс ESN.

Поместите чашку с культурой в инкубатор до наступления желаемого времени. Точечно аспирируйте культуральную среду ESN и дважды промойте extracellular recording buffer или ERB. Затем добавьте четыре миллилитра ERB, дополненного пятью micromolar тетродотоксина для блокирования потенциалов действия и 10 micromolar биколина для антагонизма активности рецепторов gabaa.

Затем перенесите чашку на установку для электрофизиологических исследований. Для измерения ингибирования синаптической передачи или проведения анализа на мистоз перфузия и контроль температуры не требуются. После вытягивания двух силикатных пипеток с помощью микропуллера до достижения сопротивления от 5 до 10 mega ohms, заполните пипетку буфером для внутриклеточной регистрации.

Затем осторожно окуните пипетку в силиконовый реагент. Закрепите регистрирующую пипетку в держателе для электродов и подсоедините заполненный воздухом шприц к трубке, которая входит в держатель для электродов. Создавая шприцем постоянное положительное давление, опустите регистрирующую пипетку в ERB.

После осторожного соприкосновения регистрирующей пипетки с SOR исследуемого нейрона проверьте наличие положительного давления, разгерметизировав шприц. Снова подсоедините шприц и примените устойчивое отрицательное давление путем плавного втягивания воздуха для формирования гигаомного контакта.

После формирования гигаомного контакта снизьте удерживающее напряжение до −70 millivolts. Затем осторожно подайте короткие импульсы отрицательного давления с помощью шприца, чтобы перейти к конфигурации целой клетки. В течение 30 секунд следите за скачками емкости, чтобы подтвердить стабильность патча.

Отключите компенсацию скачков емкости в программном обеспечении HEA и переключитесь в режим фиксации тока (current clamp) для мониторинга и записи потенциала покоя мембраны без поправки на потенциал жидкостного перехода. Потенциал покоя мембраны может составлять от -67 до -82 мВ. Установите коэффициент усиления на 2 мВ на пА.

Переключитесь в режим фиксации потенциала (voltage clamp) и проводите непрерывную запись при -70 mV в течение трех-пяти минут для регистрации миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов. Проанализируйте три-пять минут записанных данных для выявления mEPSCs, используя стандартные настройки для EPCs AMPA-рецепторов в программе mini analysis; соберите и сохраните информацию о зарегистрированных событиях. Соберите данные о частоте mEPSCs для восьми-12 контрольных образцов и восьми-12 образцов, обработанных ботулиновым нейротоксином, для каждого условия воздействия.

Проанализируйте частоту по сравнению с контрольными группами, соответствующими по возрасту и партии, затем определите статистическую значимость процента ингибирования синаптической активности с помощью подходящих статистических тестов. С 7-го по 49-й день in vitro (div) ESN экспрессируют нейротропные компартменты и формируют синаптические пунктуры. Таксо-дендритные интерфейсы. ESN подвергаются ингибированию синаптической активности при воздействии ботулотоксина серотипов A, TG и тетанового токсина.

Эти репрезентативные записи с ESN были получены через 20 часов после добавления в ванну ботулотоксина серотипа A, тетанус-нейротоксина или контрольного раствора. Каждый нейротоксин снизил синаптическую активность более чем на 95% по сравнению с контролем. Следующие четыре изображения демонстрируют чувствительность метода mEPSС при измерении моносинаптической активности в ESN, обработанных ботулотоксином серотипа A.

На этом первом изображении представлены репрезентативные записи пропущенных измерений синаптической активности через 20 часов после добавления ботулотоксина серотипа A в ванну. Сегменты записей при фиксированном потенциале демонстрируют снижение частоты M-E-P-S-C после воздействия ботулотоксина серотипа A. На данном изображении показан количественный анализ частоты M-E-P-S-C, который подтверждает дозозависимое снижение частоты M-E-P-S-C. Медианная ингибирующая концентрация была определена методом наименьших квадратов с помощью нелинейной регрессии с использованием четырехпараметрической переменной кривой. Обратите внимание, что предел обнаружения в SNS составляет не менее 0,005 picaMolar.

На данной столбчатой диаграмме представлены результаты цитометрического количественного определения расщепления SNAP 25, измеренного методом вестерн-блоттинга. Обратите внимание на снижение чувствительности расщепления snare-белков как показателя интоксикации. По сравнению с группой mist одна звездочка указывает на значение P менее 0.05.

Три звездочки указывают на значение P менее 0.001. Эти результаты демонстрируют, что сетевые популяции нейронов, полученных из стволовых клеток, представляют собой физиологически релевантную клеточную модель отравления нейротоксином клостридий. Ожидается, что использование SNS позволит значительно снизить уровень стресса и смертности животных, служа подходящей заменой тесту на летальность у мышей с дополнительным преимуществом в виде повышенной скорости, специфичности и чувствительности.

Данный метод открывает перед исследователями в области нейротоксикологии возможность применения методов скрининга со средней пропускной способностью, основанных на анализе активности нейронных сетей, для облегчения терапевтического скрининга и обнаружения нейротоксинов клостридий.