Proteoliposome-Based Efflux Анализ для определения одиночных молекул Свойства Cl ^- Каналы и перевозчиков

Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении транспортной активности восстановленных хлоридных каналов или транспортеров. Это достигается путем предварительного восстановления чистого очищенного транспортера в липосомы с низкой плотностью, чтобы каждая липосома содержала либо ноль, либо одну копию активного комплекса, после удаления внешних ионов хлора так, чтобы существовал направленный наружу ионный градиент, липосомы добавляются в регистрирующую камеру, где концентрация хлорида контролируется с помощью чувствительного к хлориду электрода. Следующее выделение хлорида из липосом инициируется добавлением Val Mycin, ионофора калия, который активизирует мембранный потенциал.

Как только сигнал достигает устойчивого состояния, эксперимент завершается добавлением детергента для растворения липосом. В конечном счете, измеряя скорость оттока хлоридов из липосом, восстановленных с помощью очищенного канала или транспортера, можно количественно определить единую скорость транспорта и стехиометрию активного белкового комплекса. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими существующими подходами, такими как флуоресцентные измерения потока, заключается в том, что с его помощью можно количественно определить ключевые параметры восстановленного транспортера, такие как единичная скорость оборота и геометрия комплекса.

В дополнение к количественному измерению этих ключевых параметров, этот метод может быть использован для быстрого и точного определения эффекта мутации малых молекул и мониторинга субъединиц в восстановленном транспортном белке. Записывающая установка состоит из двух камер, хлоридного электрода, pH-метра с аналоговым или цифровым электрическим выходом, дигитайзера и компьютера с соответствующим программным обеспечением для сбора данных. Подключите хлоридный электрод к pH-метру, затем подключите выход pH-метра к дигитайзеру, который подключен к компьютеру.

Поместите электрод сравнения в одну камеру, а проволоку для перекодировки — в другую. Затем поместите камеры на перемешивающую пластину с мешалкой в камеру записи. Следите за тем, чтобы мешалка не касалась электрода.

Соедините камеры с помощью агарового моста, в ночь перед экспериментами набухните один грамм шариков cidex G 50 в 15 миллилитрах внешнего буфера с легким встряхиванием в течение не менее трех часов при комнатной температуре перед использованием. Для каждого эксперимента требуется примерно три миллилитра набухших шариков, в то время как липосомы оттаивают при комнатной температуре. В каждую колонку насыпьте примерно три миллилитра набухших бусин G 50

Дайте им высохнуть под действием силы тяжести. Протекать при комнатной температуре. Обычно это занимает одну-две минуты.

Затем подготовьте уличные везикулы, выдавив липосомы протеи 11 раз через мини-экструдер с использованием тефлонового среза 0,4 микрона. Затем поместите колонку в пластиковую центрифугу с круглым дном на 20-30 секунд при 1400 G в клинической центрифуге для удаления излишков раствора. После этого, защищая сквозной поток, поместите колонну в стеклянную трубку размером 13 на 100 миллиметров и добавьте в колонну 100 микролитров выдавленных пузырьков.

Вращайте колонку в течение одной минуты при 500 G.In клинической центрифуге, соберите примерно 200 микролитров потока, через который будет добавлено в регистрирующую камеру. Чтобы выполнить измерение оттока, поместите два миллилитра 100 миллимолярного хлорида калия в референсную камеру и 1,8 миллилитра внешнего буфера в записывающую камеру. Запустите программу приобретения.

Пусть базовая линия уравновешивается. Это может занять несколько минут. Как только сигнал достигнет стабильного базового уровня, начните запись.

Добавьте 15 микролитров желтовато-коричневого молярного раствора хлорида калия для калибровки системы. Затем добавьте липосомы. Небольшой скачок может быть заметен из-за неполного удаления внешнего хлорида из липосом.

Подождите, пока базовая линия стабилизируется. Затем добавьте CIN для инициации flx. Пусть FLX идет своим ходом времени, пока не выйдет на плато.

К этому моменту добавьте 40 микролитров 1,5 моляра бета-окта-глюкозида, приготовленного во внешнем буфере, чтобы растворить все липосомы. Затем подождите от 10 до 15 секунд. Завершите запись и перейдите к анализу данных, как описано в текстовом протоколе.

Когда липосомы, содержащие высокое содержание хлорида внутри организма, погружаются в липосомы, содержащие низкое содержание хлорида, образуя 300-кратный градиент хлоридов, чистый поток ионов не наблюдается. Это связано с тем, что свободные от белка липосомы имеют низкую внутреннюю проницаемость для ионов. Макроскопические FLX не наблюдаются из протлипосом, восстановленных с помощью протонного связанного переносчика хлоридов, C-L-C-E-C one.

Поскольку небольшое количество хлорида, выходящего из веско, накапливает суммарный положительный заряд в липосоме, добавление CIN позволяет ионам калия перемещаться по мембране, снижая электрический потенциал и инициируя хлорид FLX. Реакцию прекращают и измеряют общее количество ионов хлора, содержащихся в везикулах, чтобы определить свойства отдельных восстановленных белков. Исходные данные о временном ходе оттока сначала преобразуются из милливольт в концентрацию хлоридов, а затем нормализуются временные данные, а затем подгоняются.

Определено, что постоянная времени оттока равна 41 секунде, а доля липосом, содержащая ноль активных копий C-L-C-E-C one, равна точке 31, что указывает на то, что примерно одна треть липосом содержит ноль активных белков из этих значений, и измеряет содержание хлоридов в везикулах, содержащих по меньшей мере одну копию C-L-C-E-C one, Можно определить единую скорость переноса C-L-C-E-C, равную примерно 2500 ионам хлора в секунду. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить необходимость оборота перевозчика. Эти эксперименты можно провести за 10-15 минут при тщательном выполнении.

Очень важно тщательно оценивать качество липосом, так как утечки негативно влияют на оценки скорости оборота.