Моделирование жизненного цикла Эбола Вирус Меньше уровень биологической безопасности 2 Условия вирусом типа частиц, содержащих Tetracistronic Minigenomes

Общая цель следующего эксперимента заключается в моделировании жизненного цикла высокопатогенного вируса Эбола в условиях второго уровня биобезопасности. Это достигается путем получения вирусоподобных частиц, которые имеют такой же белковый состав, как и частицы вируса Эбола, но несут мини-геном вместо вирусного генома. Мини-геном представляет собой миниатюрную версию вирусного генома, в которой вирусные гены удалены и заменены репортерным геном, таким как люцифераза.

Важно отметить, что мини-геном, используемый в данном эксперименте, также содержит ряд вирусных генов, кодирующих вирусные белки VP40, GP-1, GP-2 и VP24. Вирусоподобные частицы получают путем экспрессии мини-генома в клетках 293T, называемых клетками-продуцентами, совместно с вирусными белками NP, VP35, VP30 и L, которые в совокупности также называют белками RNP.

Затем мини-геном реплицируется и транскрибируется в мРНК с помощью вирусных белков. мРНК кодируют репортерную люциферазу и дополнительные вирусные белки VP40, GP-1,2 и VP24. Совместно эти три белка приводят к образованию вирусоподобных частиц, которые называются транскрипционно и репликативно компетентными вирусоподобными частицами или TRVLP, так как содержащиеся в них нуклеокапсиды способны осуществлять репликацию генома и транскрипцию. Поскольку TRVLP несут гликопротеин вируса Эбола GP-1,2, они способны инфицировать клетки-мишени.

Эти клетки-мишени были предварительно трансфицированы экспрессионными плазмидами для np, VP35, VP30 и L. Совместно эти белки РНП распознают минигеном, который был доставлен в клетки-мишени внутри TRVLP. Затем происходит репликация и транскрипция минигенома, что приводит к активности репортерного гена, а также к продукции новых TRVLP, которые могут быть снова использованы для инфицирования новых клеток-мишеней.

Важно отметить, что минигеном не содержит генетической информации, необходимой для его репликации. Следовательно, TRVLP не могут продуктивно заражать клетки, которые не экспрессируют четыре белка РНП. Это делает систему безопасной для использования в условиях второго уровня биобезопасности.

Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет моделировать полный жизненный цикл вируса, включая репликацию генома, экспрессию продуктов вирусных генов, продукцию вирусных частиц и заражение клеток-мишеней на протяжении нескольких циклов в условиях второго уровня биологической безопасности. Это означает, что данная работа может быть выполнена без использования лаборатории с максимальным уровнем изоляции, которая в противном случае необходима для работы с живыми вирусами Эбола. Этот метод можно сочетать с другими техниками, такими как РНК-опосредованный нокдаун клеточных факторов или сверхэкспрессия этих факторов, для изучения их роли в биологии вируса. Кроме того, мы можем вносить мутации в вирусные гены, чтобы изучить роль этих генов и их продуктов в биологии вируса.

Проведите пересев клеток: удалите среду из культура с 80–90% конфлюэнтностью клеток 293T, дважды промойте их PBS и добавьте к клеткам два миллилитра трипсина. Дождитесь, пока клетки округлятся.

Затем отделите клетки, слегка постукивая по колбе, и добавьте к ним 8 mL среды с 10% FBS. Подсчитайте количество клеток с помощью автоматического счетчика, затем разведите клетки до концентрации 2 × 10⁵ клеток на мл и внесите по 2 mL в каждую лунку 6-луночного планшета. Поместите клетки обратно в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% CO2. Через 24 часа проведите трансфекцию клеток плазмидами, необходимыми для продукции TRVLPs. В ламинарном шкафу (BSC) перенесите ДНК в пробирку, используя наконечники с фильтром. В качестве отрицательного контроля в одной лунке следует исключить плазмиду, кодирующую вирусную полимеразу L; вместо нее можно трансфицировать плазмиду, кодирующую GFP, для визуализации эффективности трансфекции. Затем добавьте к ДНК по 100 µL Opti-MEM на каждую лунку. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе и центрифугируйте для осаждения.

Затем добавьте 7,5 µL реагента для трансфекции transIT LT-one к разведенной ДНК. Осторожно перемешайте содержимое пробирки на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. По истечении 15 минут аккуратно перемешайте трансфекционную смесь, несколько раз втянув и вытолкнув её пипеткой, затем по каплям внесите по 100 µL смеси в каждую лунку планшета на шесть лунок.

После добавления комплексов для трансфекции в клетки аккуратно покачайте планшет вперед-назад и из стороны в сторону. Не вращайте планшет круговыми движениями, так как это приведет к неравномерной трансфекции. Затем верните клетки в инкубатор. Через 24 часа после трансфекции удалите супернатант. Затем добавьте в клетки четыре миллилитра среды с 5% FBS и снова поместите их в инкубатор.

Через 24 часа после трансфекции клеток-продуцентов проведите пересев клеток 293T, как описано ранее. Через 24 часа после пересева трансфицируйте их плазмидами, кодирующими белки RNP вируса Эбола, а также Tim-1, который служит фактором адгезии для вирусов Эбола. Через 72 часа после трансфекции клеток-продуцентов и через 24 часа после трансфекции клеток-мишеней соберите супернатант с клеток-продуцентов и перенесите его пипеткой в пробирку объемом 15 мл.

После сбора супернатанта удалите всю оставшуюся жидкость, добавьте 250 мкл буфера для глоу-лизиса к клеткам и инкубируйте их не менее 10 минут при комнатной температуре. После этого определите активность люциферазы, как описано в третьем шаге данного видео. Тем временем центрифугируйте супернатант клеток-продуцентов в течение пяти минут при 800 g и комнатной температуре.

Затем удалите среду из целевых клеток и добавьте три миллилитра осветленного супернатанта из клеток P-0 к целевым клеткам. Выполняйте эту процедуру поочередно для каждой лунки. По завершении верните целевые клетки в инкубатор. Через 24 часа после инфицирования.

Удалите супернатант из целевых клеток. Затем добавьте к клеткам четыре миллилитра среды с 5% FBS и верните их в инкубатор. Для определения репортерной активности в клетках-продуцентах или целевых клетках эти клетки собирают через 72 часа после трансфекции в случае клеток-продуцентов и через 72 часа после инфицирования в случае целевых клеток.

Для этого удалите супернатант из лунок с клетками, добавьте к клеткам 250 microliters буфера для лизиса glow и инкубируйте их не менее 10 минут при комнатной температуре. При необходимости супернатант можно использовать для заражения новой порции целевых клеток. В этом случае соберите супернатант и заразите целевые клетки, как описано в шаге два этого видео.

Тем временем разморозьте по 40 µL буфера для анализа люциферазы на лунку и добавьте в буфер субстрат люциферазы в объеме 1/100. Перемешайте готовый реагент для люциферазы на вортексе и убедитесь, что он достиг комнатной температуры, прежде чем продолжить. Затем перенесите по 40 µL реагента в белый непрозрачный 96-луночный планшет. Чтобы избежать перекрестных помех, рекомендуется оставлять одну лунку пустой между лунками с образцами. По окончании 10-минутной инкубации промойте клетки буфером для лизиса с помощью пипетирования и перенесите лизат клеток в пробирку. Центрифугируйте лизаты в течение трех минут при 10 000 g и комнатной температуре. После этого перенесите по 40 µL лизатов в 96-луночный планшет с реагентом для люциферазы. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре. По истечении 10 минут измерьте активность люциферазы с помощью люминометра. Время интегрирования при измерении люминесценции должно составлять одну секунду. При использовании микропланшетного люминометра Modulus типичные сигналы люминесценции для положительного контроля должны составлять примерно от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁷, в то время как сигнал для отрицательного контроля должен быть как минимум на два-три порядка ниже. В последующих пассажах активность репортера в положительных контролях должна оставаться стабильной, тогда как активность репортера в отрицательных контролях должна снизиться до фонового уровня.

После просмотра этого видео вы сможете создавать вирусные частицы, подобные вирусу Эбола, способные к репликации и транскрипции, использовать их для инфицирования клеток-мишеней и измерять активность репортера в клетках-продуцентах и клетках-мишенях.

Важно отметить, что данный метод может быть дополнен другими техниками, такими как РНК-опосредованный нокдаун клеточных факторов, для изучения роли этих факторов в биологии вируса. Кроме того, можно вносить мутации в вирусные компоненты, используемые в данном методе, чтобы изучить роль этих компонентов в жизненном цикле вируса Эбола. Дополнительные экспериментальные подробности и перечень конкретных реагентов приведены в рукописи, сопровождающей данное видео.