Лицевого нерва аксотомии у мышей: модель для изучения двигательных нейронов ответ на повреждение

Общая цель данной процедуры заключается в экстернализации лицевого нерва для изучения повреждений периферических нервов. Лицевой нерв берет начало в мосту ствола головного мозга и выходит из черепа через шило-сосцевидное отверстие, после чего нерв разделяется на свои основные ветви.

После обнажения нерв пересекают в месте его выхода из шило-сосцевидного отверстия. Для локализации лицевого нерва используются два основных ориентира. Первым из них является слуховой проход, состоящий из жемчужно-белых хрящевых пластинок, соединенных тонкой мембраной.

Другим является передний брюшек двубрюшной мышцы, который располагается над нервом в месте его выхода из шило-сосцевидного отверстия. После повреждения лицевого нерва ученый может изучить множество факторов, таких как гибель мотонейронов или экспрессия генов. Модель повреждения лицевого нерва является одной из наиболее детально изученных моделей повреждения периферических нервов.

Преимуществами данной методики являются ее простота, высокая воспроизводимость и отсутствие влияния последующего паралича лицевого нерва на жизненно важные функции. Кроме того, благодаря высокой симметрии нервной системы, неповрежденная сторона может служить парным внутренним контролем в ваших экспериментах. Для соблюдения правил асептики на протяжении всей процедуры убедитесь, что все инструменты прошли автоклавирование, а также подготовьте стеклянный стерилизатор с бусинами для стерилизации инструментов между операциями.

Подготовьте операционный стол, поместив абсорбирующую салфетку на нагревательный коврик, настроив микроскоп и закрепив носовую маску скотчем так, чтобы она находилась по краю поля зрения. После введения мыши в состояние наркоза убедитесь в отсутствии физического отклика на манипуляции, в том числе на сжатие пальца лапы. Затем перенаправьте поток газа из анестезирующей камеры в носовую маску и нанесите офтальмологическую мазь.

Положите мышь на левый бок на хирургические салфетки, поместив под них нагревательную подушку. Постоянно контролируйте дыхание животного и при необходимости регулируйте поток изофлурана для поддержания анестезии. Затем, чтобы открыть доступ к месту операции, закрепите правое ухо пластырем к носовому конусу.

Задняя ушная вена должна быть видна при прохождении через ушную раковину. Затем смочите шерсть 70% ethanol и выбрейте этот участок. После удаления шерсти очистите кожу, трижды поочередно протирая ее раствором йода и 70% ethanol до полной очистки участка.

Приступите к операции. Убедитесь, что рот расположен строго на боку, а ушная вена проходит горизонтально. Это значительно облегчит поиск лицевого нерва.

Чтобы определить место первого разреза, проследите путь задней ушной вены от ушной раковины до области позади ушного выступа. Затем, используя пружинные ножницы, сделайте разрез длиной 4 мм на расстоянии 2–3 мм позади выступа (в учебных целях). Этот разрез будет расширен для обнажения нижележащих анатомических структур.

Теперь выполните тупую диссекцию подкожного жира и фасции. Кровеносные сосуды и мышцы могут быть легко повреждены ножницами. Если возникло кровотечение.

Оказывайте давление стерильным ватным тампоном в течение не менее 30 секунд. При значительной потере жидкости введите до 0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно, используя иглу калибра 25 или 27 G. Теперь найдите лицевой нерв, ориентируясь по ключевым анатомическим признакам.

Добавочный нерв расположен поверхностно по отношению к лицевому нерву; видно, как он проходит от затылочной части черепа. Чтобы иннервировать трапециевидную мышцу, найдите хрящевой слуховой проход. Он имеет жемчужно-белый цвет и расположен ростральнее лицевого нерва.

Лицевой нерв огибает костную часть наружного слухового прохода. Затем идентифицируйте брюшко переднего живота двубрюшной мышцы, которое располагается поверх лицевого нерва и каудальнее его. Выполните диссекцию под этой структурой, чтобы обнажить лицевой нерв.

Это плотная белая структура, прикрепленная к подлежащему слою фасции. Определите основные ветви лицевого нерва. Проследите их дорсально до места их выхода из шило-сосцевидного отверстия.

Используйте тонкий пинцет, чтобы удерживать разрез открытым, и кончиком пружинных ножниц выполните диссекцию вдоль хода лицевого нерва. С помощью пинцета можно прощупать костный выступ сосцевидного отростка. Теперь найдите ствол лицевого нерва, чтобы раздавить его.

Сдавите его тонким пинцетом в течение 30 секунд, поддерживая постоянное давление. Это приведет к разрыву всех аксонов. Затем повторите сжатие под прямым углом в течение еще 30 секунд.

Поддерживайте постоянное давление во всех экспериментах. Теперь, когда соответствующие анатомические ориентиры определены, я продемонстрирую более точную хирургическую технику. Сделав небольшой разрез, проследите за ходом заднего ушного венозного сосуда от ушной раковины к области позади ушного выступа, и сделайте разрез длиной 4 мм на расстоянии 2–3 мм позади этого выступа.

Теперь аккуратно рассеките подкожный жир и фасцию, ориентируясь по трем анатомическим точкам: добавочному нерву, слуховому проходу и переднему брюшку двубрюшной мышцы. Обнажите лицевой нерв. Проследите ход лицевого нерва обратно к шило-сосцевидному отверстию, чтобы достичь ствола лицевого нерва; осторожно зафиксируйте нерв тонким пинцетом и перережьте его ножницами.

Избегайте чрезмерного натяжения нерва, иначе он может быть вырван из ствола мозга. Затем разведите культи в разные стороны или удалите сегмент нерва, чтобы исключить возможность повторного соединения. В завершение внимательно осмотрите нерв и убедитесь, что он полностью перерезан.

После завершения экзотомии верните все жировые ткани и мышцы в их исходное положение. Затем закройте рану с помощью скобок для кожи размером 7,5 мм или цианоакрилатного клея. При необходимости введите анальгетики, прекратите подачу анестезии и поместите мышь в пустую клетку без подстилки.

Пока животное приходит в себя, осмотрите его на наличие признаков лицевого паралича; при этом вибриссы будут парализованы. Если они отклонены назад в сторону щеки, нос будет выглядеть смещенным, а глаз не будет моргать в ответ на поток воздуха. Если животное женского пола, поместите ее в клетку с другой самкой.

Однако, если мышь остается одна, до восстановления функции мигания глаз ежедневно наносите офтальмологическую мазь для предотвращения осложнений со стороны роговицы. В это же время наблюдайте за мышью на предмет признаков инфекции или других осложнений до полного заживления места хирургического вмешательства. Существуют значительные различия в потере мотонейронов после эксоцизии в зависимости от возраста и генетического фона мышей; в животных дикого типа, которым перереззание лицевого нерва было проведено в возрасте восьми недель.

Примерно 86% мотонейронов выживают через 28 дней после экзотомии. Значительно более выраженная гибель клеток наблюдалась в модели бокового амиотрофического склероза на мышах SOD1, а также в линии иммунодефицитных мышей с нокаутом гена Rag2 при лазерном микродиссекировании.

Для выделения материала из ядра лицевого нерва использовали микродиссекцию. Можно было выделить все ядро лицевого нерва целиком или же собирать его отдельные субъядра по отдельности.

Данный метод обладает высокой точностью. Мотонейроны могут быть захвачены по отдельности, а оставшийся фрагмент нейронного кластера также может быть собран для последующего анализа. Для исследования экспрессии генов в образцах субъядер вентромедиального субъядра (обозначено пунктирной линией) и вентролатерального субъядра (обозначено сплошной линией) использовали количественную ПЦР. Была измерена экспрессия четырех генов, связанных с ответом на регенерацию нервов.

Между этими субъядрами были обнаружены некоторые различия. Наибольшая разница в экспрессии Gap 43 наблюдалась между субъядрами. После освоения данной техники операция может быть выполнена всего за несколько минут.

Важно помнить о правильном позиционировании животного, выполнении разреза в нужном месте и использовании анатомических ориентиров для поиска лицевого нерва. В области головы и шеи легко потерять ориентацию, поэтому, если вы затрудняетесь с поиском, найдите хрящевую часть наружного слухового прохода и проследите за ней в заднем направлении, чтобы обнаружить лицевой нерв.