Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

Общая цель данного эксперимента заключается в создании системы совместного культивирования для оценки способности нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, формировать функциональные связи с помощью генетического подхода, основанного на фотостимуляции культивируемых нейронов через канальный родопсин-2 или ChR2. Это достигается путем первоначального выделения первичных нейральных стволовых клеток (NPC) мыши и их последующей дифференцировки в астроциты. Затем первичные кортикальные нейроны крысы трансфицируют ChR2 и высевают на слой астроцитов, который служит существующей популяцией нейронов.

Затем нейрональные клетки-предшественники (NPC) человека, полученные из культур индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), трансдуцируют вирусом synapsin one 2D tomato, после чего их высевают на культуру астроцитов и нейронов и индуцируют к дифференцировке, в результате чего формируются синаптические связи. Результаты показывают, что нейроны, полученные из IPSC, образуют синаптические связи с кортикальными нейронами крысы, что подтверждается электрофизиологическими записями постсинаптических токов в нейронах, полученных из IPSC, при генетической фотостимуляции кортикальных нейронов, экспрессирующих CHR two. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как совместное культивирование только астроцитов с нейронами человека, полученными из IPSC, является сокращение времени созревания этих нейронов человека.

Это объясняется тем, что присутствие первичных нейронов может ускорить созревание этих нейронов человека. Процедуру продемонстрируют Юни Чин, аспирант моей лаборатории, и Суинг Й из лаборатории Джорджа Августина. После извлечения головного мозга эмбриона крысы и выделения кортикальной ткани согласно текстовому протоколу перенесите кортикальные ткани в чашку с предварительно подогретым раствором для переваривания кортикальной ткани. Измельчите кортикальные ткани как можно мельче, после чего инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. По завершении инкубации перенесите кортикальные ткани в центрифужную пробирку объемом 50 мл и диссоциируйте ткани с помощью серологической пипетки до получения гомогенного раствора без фрагментов ткани.

Пропустите суспензию ткани через клеточный фильтр с порами 70 микрон, чтобы удалить оставшиеся комочки ткани. Перенесите по 3 мл раствора в центрифужные пробирки объемом 15 мл.

Добавьте 800 µL 7,5% BSA в одном XPBS на дно каждой пробирки, чтобы создать слой под слоем ткани, и центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут. Затем удалите супернатант, аспирируя его с границы раздела двух слоев. Старайтесь не задеть осадок селенок на дне пробирки.

После ресуспендирования каждого осадка клеток в 1 мл среды для первичных нейронов объедините их в центрифужной пробирке объемом 15 мл. Затем с помощью гемоцитометра определите плотность клеток. Центрифугируйте 6 миллионов кортикальных нейронов крысы при 200 ×g в течение пяти минут и удалите супернатант.

Для электропорации требуется не менее 6 миллионов кортикальных нейронов. Чтобы обеспечить формирование нейронной сети из выживших нейронов, добавьте 100 µL раствора для электропорации к клеточному осадку и осторожно ресуспендируйте. Затем смешайте 100 µL клеточной суспензии с шестью µg плазмиды CR two и перенесите смесь в сертифицированную кювету.

Выберите и примените соответствующую программу электропорации согласно инструкциям производителя. После электропорации добавьте 500 µL MEM в кювету. Перенесите клетки в 11,5 мл первичной среды для нейронов и аккуратно ресуспендируйте.

Затем добавьте по 500 µL в каждую лунку 24-луночного планшета с астроцитами мыши. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO2. После получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) индуцируйте и поддерживайте клетки в виде культуры нейральных стволовых клеток (NPCs) человека в соответствии с текстовым протоколом.

В данном примере нейрональные стволовые клетки (НСК) маркируются с помощью лентивирусного вектора synapse in one TD tomato на следующий день после добавления первичных нейронов в культуру астроцитов. Используйте 1XPBS для однократного промыва человеческих НСК, затем добавьте раствор для отсоединения клеток и инкубируйте в течение пяти минут при 30 °C. Убедитесь, что все клетки отсоединились.

Затем перенесите их в пробирку объемом 15 мл, содержащую двойной объем D-M-E-M-F 12, и центрифугируйте при 200 G в течение пяти минут. Удалите супернатант и с помощью среды для нейрональной дифференцировки осторожно ресуспендируйте осадок до состояния одиночных клеток. Для подсчета количества клеток используйте гемоцитометр.

Затем осторожно аспирируйте среду из планшета с культурами кортикальных нейронов и астроцитов. Добавьте человеческие NPCs в концентрации 5 000 клеток на квадратный сантиметр на лунку в среде для нейрональной дифференцировки. Инкубируйте при 37 °C и 5% CO2, заменяя среду каждые два или три дня в течение как минимум 28 дней.

Чтобы подтвердить, ведут ли себя человеческие IPC так же, как зрелые нейроны, используйте конфокальный микроскоп, оснащенный 60-кратным объективом с иммерсией в воду, чтобы найти клетки, дифференцированные из человеческих IPC. Визуализируйте TD tomato. Изготовьте записывающую пипетку с сопротивлением от 4 до 6 Ом.

Клетки выдерживали при комнатной температуре во внешнем растворе с постоянным барботированием смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа. С помощью внутреннего раствора заполните записывающую микропипетку, проведите патч-кламп клетки TD tomato-положительного томата в режиме всегоp-клеточного This-конфигурации (whole cell) и зарегистрируйте генерацию потенциалов действия в ответ на инъекцию тока в режиме фиксации тока (current clamp). Подтвердите, что потенциал действия кортикальных клеток, экспрессирующих ChR2, надежно вызывается световой стимуляцией.

Сначала найдите клетки коры, экспрессирующие CR two, путем визуализации GFP с помощью освещения ртутной дуговой лампой и использованием фильтра возбуждения с длиной волны 480/40 нм. Убедитесь, что потенциал действия надежно вызывается с помощью записи в режиме фиксации тока (current clamp) в конфигурации «целая клетка» (whole cell). Для проведения генетической стимуляции установите патч-зажим на клетке, положительной по TD tomato, в режиме «целая клетка» и установите потенциал фиксации напряжения (voltage clamp) на уровне -70 мВ при освещении всей области ртутной лампой и использовании фильтра возбуждения 480/40 нм.

Стимулируйте всё поле в течение 30 секунд. Зарегистрируйте постсинаптические токи или PSCs в клетке с фиксированным потенциалом, вызванные фотостимуляцией пресинаптических кортикальных нейронов, экспрессирующих CHR2. Установите порог амплитуды и площади токов на уровне 5 pA и pA² соответственно; вручную проверьте эти события, чтобы исключить любые трассы, не являющиеся PSC.

Как показано в данном видео, для создания кокультуры нейронов, полученных из IPCs, первичных кортикальных нейронов и астроцитов требуется выполнение нескольких этапов. На этом изображении видно, что на второй день дифференцировки NPC мыши в астроциты легко наблюдаются астроциты, положительные по глиальному фибриллярному кислому белку или GFAP. NPC мыши дифференцировали в течение как минимум одной недели перед высевом кортикальных нейронов, экспрессирующих CR two, на монослой астроцитов; оба типа клеток идентифицируются в данной кокультуре с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на GFAP и CHR two.

После трех-четырех недель дифференцировки человеческих NPC в культурах были обнаружены нейроны, положительные по TD tomato, как показано здесь. При стимуляции светом в кортикальных нейронах, экспрессирующих CHR two IPSC, генерировались потенциалы действия. Полученные нейроны также являются возбудимыми, демонстрируя повышенную активность.

Потенциал возбуждения при увеличении амплитуды деполяризующих импульсов тока. В отсутствие света нейроны, полученные из IPSC, получали спонтанные синаптические входы. Эти входящие постсинаптические токи опосредовались преимущественно AMPA-рецепторами.

Фотостимуляция кортикальных нейронов поддерживалась на протяжении 32-й длительной световой вспышки, при этом частота PSC была повышена. При фотостимуляции кортикальных нейронов, экспрессирующих CHR2, их амплитуда осталась неизменной. После выполнения данной процедуры можно использовать другие системы кокультивирования с различными типами специфических клеток пациентов для поиска ответов на дополнительные вопросы, такие как влияние перспективных лекарственных соединений на конкретные интересующие заболевания.