Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Общая цель этой процедуры заключается в получении большого количества вируса гриппа с высоким титром в экономически эффективной системе. Это достигается путем получения свежеоплодотворенных куриных яиц, не содержащих патогенов в сыворотке крови. На втором этапе яйца заражаются вирусом гриппа через корень Алана Тоика.

В течение 48 часов жидкость Алана Тоика, содержащая вирус, собирается, а вирус замораживается в жидком азоте. В конечном счете, можно провести анализ бляшек и гемагглютинина для определения влияния титра вируса собранного Алана Тоика. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы сбора очень чувствительны и требуют бережного обращения с яйцеклетками и хорошего знания их анатомии.

Перед началом процедуры получена свежеоплодотворенная яйцеклетка давиана без возбудителя сывороточного микроорганизма от подходящего поставщика. Сразу по прибытии поместите яйца в инкубатор с увлажненными яйцами с автоматическим переворачивателем яиц, чтобы регулярно поворачивать яйца при температуре 37 градусов Цельсия и влажности от 55 до 60% в течение 10-11 дней. После семи-восьми дней инкубации надевайте перчатки, продезинфицированные 70% этанолом.

Протрите свеч для яиц этанолом и переложите яйца из инкубатора в пустые коробки из-под яиц. Затем выключите свет и поднимите большой конец яиц по одному к свечу. Если яйцеклетка оплодотворена, должны быть хорошо видны тонкие кровеносные сосуды, ведущие к эмбриону в форме фасоли.

Если яйцо неоплодотворенное, будет наблюдаться небольшое кровяное пятно с видимым яичным желтком. Затем отбраковывают неоплодотворенные яйца и возвращают жизнеспособное в инкубатор. Если состояние яйцеклетки не может быть подтверждено, отметьте ее для последующего наблюдения на 10 или 11 день после оплодотворения и непосредственно перед использованием разведите запас вируса гриппа А в соотношении один раз от 10 до третьего до 10 до четвертого БОЕ на миллилитр в стерильном PBS с добавкой хиппи и положите его на лед.

Затем снова зажгите каждое яйцо и удалите все мертвые неподвижные эмбрионы. Далее достаньте из инкубатора три яйца и разложите их в отдельном держателе. Когда воздушные мешки подняты, отметьте воздушное пространство яиц постоянным маркером.

Затем промойте область над воздушным пространством 70% этанолом и перенесите воздушное пространство для яиц в картонную коробку для яиц в пределах биозащитного колпака BSL два. Теперь с помощью стерильной иглы 18 калибра проделайте небольшое отверстие в скорлупе над воздушным мешком каждого яйца. Будьте осторожны, не вводите иглу слишком глубоко, чтобы не проколоть эмбрион или желток.

Затем наберите разведенный вирус гриппа в стерильный одномиллилитровый шприц. Прикрепите иглу 22 калибра и осторожно продвинуте иглу под углом 45 градусов в полость Алана Тоика первого яйца. Введите в яйцо 0,2 миллилитра разведенного вируса, а затем после введения двух других яиц выбросьте шприц и запечатайте иглой каждое отверстие каплей клея из клеевого пистолета.

Позаботьтесь о том, чтобы клей не просочился внутрь яйца, а затем поместите яйца обратно в инкубатор. После того, как все яйца будут инокулированы, инкубируйте зараженные яйца при температуре 37 градусов Цельсия и влажности 60%, не переворачивая, для оптимального времени инкубации. В зависимости от типа вируса гриппа.

В конце инкубационного периода охладите яйца в течение как минимум четырех часов при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы убить эмбрион и сузить кровеносные сосуды. Когда яйца достаточно остынут. Переложите их в колпак с биобезопасностью и прочный держатель и очистите поверхности яиц 70% этанолом.

Затем с помощью стерильных ножниц вскройте яичную скорлупу над воздушным мешком первого яйца. Снимите скорлупу вокруг воздушного мешка. Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить мембрану хорио Алана Тоика.

Затем с помощью стерильных тупых щипцов вскройте мембрану хорио Алана Тоика и аккуратно отодвиньте в сторону эмбрион и желточный мешок с помощью небольшой лопатки или ложки, стараясь не разорвать желток. Далее с помощью пипетки эйнора объемом в один миллилитр осторожно соберите жидкость Алана Тоика, наклонив яйцо в сторону, чтобы собрать как можно больше жидкости. Каждое яйцо должно давать от пяти до 10 миллилитров слегка желтоватой жидкости по мере сбора каждого яйца.

Скапливайте жидкость Alan Toic в пластиковых конических трубках объемом 50 миллилитров на льду. Когда вся жидкость будет собрана, раскрутите вирус и переложите прозрачную жидкость в новую 50-миллилитровую трубку со льдом. Наконец, выбросьте яйца в контейнер для отходов BSL two и немедленно превратите Eloqua в осветленную жидкость LAN.

Затем заморозьте вирус в жидком азоте и поместите замороженные стебли в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. При длительном хранении вирусная инфекция гриппа вызывает цитопатический эффект, в результате которого на монослое клеток образуются круглые зоны из ажурных клеток или бляшки. В этом эксперименте бляшки визуализировали путем окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым цветом, и 65 бляшек были подсчитаны в лунке с умноженным на 10 и отрицательным 12 разведением вируса, потому что на клетках культивировалось 500 микролитров разбавленного вирусного запаса.

В этом эксперименте итоговый титр составил 1,3 умножить на 10 к 14-му БОЕ на миллилитр. Анализ гемагглютинина — это метод титрования вируса гриппа, основанный на способности вируса прикрепляться к поверхности эритроцитов. Как было замечено, вирусная суспензия агглютинирует эритроциты, препятствуя осаждению эритроцитов из суспензии.

Однозначно отрицательный результат наблюдался при двукратном минус 10-м разведении вируса в 50 мкл. Таким образом, итоговый титр составляет 2,1 умножить на 10 к четвертой ХАУ на миллилитр. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как размножать вирус гриппа путем инокуляции куриных яиц и сбора атлантической жидкости, содержащей вирус.