Запись Light-вызывала постсинаптические реакции нейронов темно-адаптированных, мышь сетчатки ломтик препаратов с использованием методов локальной фиксации

Общая цель данного эксперимента — получить записи светового ответа от нейронов сетчатки, адаптированных к темноте. Это достигается путем предварительного извлечения глаза мыши. На втором этапе изолируют сетчатку и нарезают ее для приготовления срезов.

Затем препарат сетчатки закрепляют и рассматривают под микроскопом для поиска целевой клетки для проведения патч-кламп записей. После установления конфигурации патч-клампа в режиме всей клетки (whole cell) в области клетки подают световой стимул. Наконец, с помощью программного обеспечения для сбора данных наблюдают одновременный электрофизиологический ответ.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как визуализация KRC, является высокая чувствительность записи и возможность морфологической идентификации регистрируемых клеток. Как правило, новичкам в этом методе бывает сложно, так как работа в полной темноте может быть затруднительной и дезориентирующей для тех, кто к ней не привык. Для начала подготовки расположите инструменты для диссекции и переносные пипетки рядом с диссекционным микроскопом.

Рабочая зона должна быть хорошо организована, чтобы к каждому инструменту можно было легко получить доступ в темноте. Когда все будет готово, используйте инфракрасный визир для проведения процедуры в темноте. После эвтаназии быстро проведите энуклеацию глаз и поместите их в чашку с холодным диссекционным раствором, помещенную в темный бокс, работая под микроскопом.

Перенесите глаз в чашку с охлажденным диссекционным раствором, в который непрерывно подается кислород. Чтобы удалить роговицу и хрусталик, удерживайте зрительный нерв на другом конце глазного яблока, чтобы предотвратить его смещение, и сделайте надрез в верхней части роговицы микрохирургическим ножом.

Увеличьте разрез с помощью хирургических ножниц и удалите роговицу, оставив вокруг нее часть склеры. Затем захватите хрусталик тонким пинцетом и медленно извлеките его. После формирования глазной чаши осторожно залейте в нее холодный оксигенированный диссекционный раствор с помощью небольшой переносной пипетки.

Работайте быстро, чтобы сохранить форму сетчатки, и используйте осторожное давление для определения дорсальной и вентральной сторон сетчатки. Используйте инфракрасные видоискатели, чтобы определить линию, проходящую через чашу глазного яблока вблизи головки зрительного нерва. Эта линия проходит преимущественно через вентральную сторону зрительного нерва; противоположная сторона, включая зрительный нерв, является дорсальной.

В зависимости от условий эксперимента сделайте разрез либо с вентральной, либо с дорсальной стороны. Это позволит пометить ненужную сторону, что будет полезно при дальнейшей работе. Затем осторожно удалите стекловидное тело с помощью сверхтонких пинцетов, не касаясь сетчатки.

Стекловидное тело прикреплено преимущественно к дну и внешнему краю глазной чаши. Поскольку стекловидное тело может быть плотно прикреплено к глазной чаше, осторожно выполняйте отслойку сетчатки. Продолжайте тянуть до тех пор, пока не исчезнет натяжение.

После выделения сетчатки захватите склеру и осторожно отделите сетчатку. Используя тыльную сторону пинцета, подрежьте сетчатку и удалите ненужную половину в ту же пластиковую чашку. Разрежьте оставшуюся часть сетчатки на два фрагмента.

Обрежьте края, чтобы сформировать слэб сетчатки, и подровняйте сгибы. Затем с помощью большой переносной пипетки перенесите слэб сетчатки на стеклянную пластину. Удалите излишки раствора маленькой пипеткой и прижмите слэб кусочком фильтровальной бумаги для выравнивания.

С помощью небольшого трансфер-пипетки осторожно поместите фрагмент фильтрующей мембраны на ткань. Нанесите каплю раствора для диссекции на фильтрующую мембрану. Подождите около 15 секунд, пока раствор распределится и прикрепит ткань сетчатки к фильтрующей мембране.

После прикрепления осторожно залейте холодным диссекционным раствором пространство под фильтром и вокруг него, пока мембрана не всплывет. Затем поместите мембрану с тканью в камеру для срезания и залейте диссекционным раствором. Действуйте быстро, чтобы мембрана не пересохла, и с помощью чоппера нарежьте ткань сетчатки на срезы.

Поместите пластиковый покровный стеклом с жировыми бортиками в камеру для срезов. Перенесите срез сетчатки на жировые бортики и поверните срез на 90 градусов так, чтобы был виден поперечный разрез. Прижмите фильтрационную мембрану к покровному стеклу, после чего зафиксируйте края фильтровальной бумаги жиром.

После иммобилизации срезов на пластиковом покровном стекле перенесите его в пластиковую чашку диаметром 33 мм. Погрузите препарат в раствор для диссекции и поместите каждую чашку в темный бокс с непрерывной оксигенацией. Для проведения записей методом патч-клампа.

Заполните перфузионные трубки средой AIMS и дайте всем пузырькам воздуха выйти из трубок. После изготовления записывающих пипеток с помощью стеклянного пуллера заполните кончик пипеточного раствора. Затем с помощью микродозатора заполните примерно одну треть объема каждой пипетки; после заполнения поместите каждую пипетку в увлажненный контейнер для пипеток.

Затем включите оборудование для проведения локальной фиксации потенциала (patch-clamp), включая компьютер, усилитель, CCD-камеру и микроскоп, работающие в темноте. С помощью инфракрасного визиера поместите препарат среза сетчатки на предметный столик микроскопа. После иммобилизации препарата начните непрерывную перфузию.

Установите температуру перфузии в диапазоне от 33 до 37 °C. Рассмотрите поверхность среза с помощью CCD-камеры. Сфокусируйтесь на целевой области.

Найдя целевые типы клеток, выберите жизнеспособную клетку для регистрации методом патч-клампа. После идентификации подходящей клетки поместите записывающую пипетку в держатель и подведите ее к препарату среза. Когда пипетка окажется близко к препарату, найдите ее кончик с помощью микроскопа.

Как только наконечник пипетки станет виден под микроскопом, переместите его вниз к целевой клетке. Затем настройте усилитель и отрегулируйте пипетку на pika amp. Пять вольт на Nana amp.

Подайте непрерывный электрический импульс амплитудой примерно 5 мВ и частотой около 10 Гц и проверьте сопротивление пипетки. Идеальное сопротивление для большинства нейронов сетчатки составляет от 5 до 12 МОм.

Когда будете готовы, используйте мундштук или шприц, чтобы выдуть внутренний раствор, пока кончик пипетки не окажется на поверхности целевой клетки. Когда под действием положительного давления на поверхности клетки появится небольшая лунка, слегка продвиньте кончик вперед и прекратите выдувание. Если сопротивление пипетки непрерывно растет, оставьте ее и контролируйте сопротивление до тех пор, пока оно не превысит один гОм.

Если сопротивление не увеличивается спонтанно, осторожно приложите отрицательное давление до образования гигаомного уплотнения (giga seal). После достижения гигаомного уплотнения измените удерживающий потенциал на -70 мВ, затем периодически прикладывайте отрицательное давление для разрыва мембраны внутри кончика пипетки. При переходе в конфигурацию «целая клетка» (whole cell) сопротивление пипетки может составлять от 500 МОм до 1 ГОм, при этом наблюдается емкостный ток.

Запишите вольт-амперную (ВА) характеристику в диапазоне от -80 до 40 милливольт. В зависимости от типа клеток будут активироваться различные типы потенциал-зависимых каналов. В завершение запишите вызванные светом синаптические токи или напряжения.

Этот срез при увеличении 10х демонстрирует как фоторецепторы, так и ганглионарные клетки без отслоения от фильтровальной бумаги. При рассмотрении данного препарата с помощью объектива 60х четко видны все клеточные слои. Световые возбуждающие постсинаптические потенциалы нейронов сетчатки вызывались ступенчатым световым стимулом.

Амплитуда пика и время затухания варьируются в зависимости от типа и подтипа клеток. Тип клетки и ее морфологический подтип были определены с помощью серо-метки после проведения физиологических записей. Этот метод открыл ученым, занимающимся исследованиями сетчатки, возможность изучать функции естественной зрительной сигнализации, а также вклад синаптических механизмов.