Запись Light-вызывала постсинаптические реакции нейронов темно-адаптированных, мышь сетчатки ломтик препаратов с использованием методов локальной фиксации

Общая цель этого эксперимента — получить записи светового отклика от адаптированных к темноте нейронов сетчатки. Это достигается путем сбора мышиного глаза. Второй шаг – изолировать сетчатку и разрезать ее для приготовления слайса.

Затем препарат сетчатки монтируется и просматривается на микроскопе, чтобы найти клетку-мишень для записи с помощью патч-клэмпа. После установления конфигурации зажима для всей клетки в непосредственной близости от клетки подается световой стимул. Наконец, одновременная электрофизиологическая реакция может наблюдаться с помощью программного обеспечения для сбора данных.

Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как визуализация KRC, заключается в том, что чувствительность записи высока, и что записывающие клетки могут быть морфологически идентифицированы. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что работа в полной темноте может быть трудной и дезориентирующей для тех, кто не привык к этому. Чтобы начать работу с диапазона, инструменты для препарирования и перенос пипеток подносят к препарирующему микроскопу.

Рабочая зона будет хорошо организована, чтобы каждый инструмент был легко доступен в темноте. Когда все будет готово, Доун с инфракрасным зрителем проведет процедуру в темное время суток. После эвтаназии быстро зародышевывают глаза и помещают их в посуду с холодным препарирующим раствором, хранящуюся в темном ящике, работающем под микроскопом.

Переложите глаз в чашку с прохладным раствором для препарирования. Непрерывно пузырится кислородом. Чтобы удалить роговицу и хрусталик, удерживайте зрительный нерв на другом конце глазного яблока, чтобы он не двигался, и сделайте надрез на верхней части роговицы с помощью микрохирургического ножа.

Удлинейте разрез с помощью хирургических ножниц и удалите роговицу, оставив вокруг нее немного склер. Далее захватите линзу тонкими щипцами и медленно вытащите ее. После того, как наглазник будет изготовлен, осторожно налейте в него холодный насыщенный кислородом рассекающий раствор с помощью небольшой переводной пипетки.

Работайте быстро, чтобы поддерживать форму сетчатки, и используйте мягкое давление, чтобы определить дорсальную и вентральную стороны сетчатки. Используйте инфракрасные зрители, чтобы определить линию, проходящую через наглазник сетчатки и проходящую рядом с диском зрительного нерва. Эта линия проходит в основном через вентральную сторону зрительного нерва, а сторона, включая зрительный нерв, является дорсальной стороной.

В зависимости от эксперимента сделайте надрез либо на брюшной, либо на спинной стороне. Это помечает ненужную сторону и является полезным маркером для продвижения вперед. Далее аккуратно удалите стекловидное тело с помощью очень тонких щипцов, не касаясь сетчатки.

Стекловидное тело в основном крепится к дну и внешнему краю наглазника. Поскольку стекловидное тело может быть плотно прикреплено к наглазнику, осторожно приступайте к удалению отслоения сетчатки. Продолжайте тянуть, пока не перестанет ощущаться напряжение.

Как только сетчатка будет изолирована, возьмите склеру и аккуратно снимите сетчатку. С помощью тыльной стороны щипцов обрежьте сетчатку глаза и выбросьте ненужную половинку в ту же пластиковую посуду. Разрежьте оставшуюся сетчатку на две части для каждой части.

Срежьте края, чтобы получилась пластина сетчатки и обрежьте загибы краев. Затем с помощью большой переводной пипетки перенесите пластину сетчатки на стеклянную пластину. Всасывайте излишки раствора с помощью небольшой пипетки и с помощью листа фильтровальной бумаги разровняйте плиту.

Аккуратно поместите кусочек фильтрующей мембраны поверх салфетки с помощью небольшой пипетки для переноса. Каплю рассекающего раствора нанесите на мембрану фильтра. Подождите около 15 секунд, пока раствор распространится и прилипнет ткань сетчатки к фильтрующей мембране.

После склеивания налейте еще больше холодного рассекающего раствора под фильтр и вокруг него, пока мембрана не всплывет. Далее поместите фильтрующую мембрану в камеру для нарезки и залейте рассекающим раствором. Работая быстро, чтобы мембрана не пересыхала, с помощью измельчителя разрезайте ткань сетчатки на ломтики.

Поместите в камеру для нарезки пластиковую крышку со стойкими для смазки. Перенесите срез сетчатки поверх направляющих для смазки и поверните срез на 90 градусов так, чтобы был виден поперечный срез. Прижмите фильтрующую мембрану к защитному стеколу, прежде чем покрывать стенки фильтровальной бумаги смазкой.

После того как ломтики обездвижены на пластиковой крышке накладной, переложите ее в 33-миллиметровую пластиковую посуду. Погрузите препарат в раствор для препарирования угля и храните каждую посуду в темной коробке, которая постоянно насыщается кислородом. Для записи с патч-зажимом.

Загрунтуйте пробирки с целевой средой и дайте всем пузырькам выйти из трубки. После изготовления записывающих пипеток со стеклянным поляром, засыпьте наконечник раствором для пипетки. Затем с помощью наполнителя микропипетки заполните примерно одну треть пипетки после заполнения, храните каждую пипетку во влажной коробке для пипетки.

Далее включите оборудование для патч-записи растений, в том числе компьютерный усилитель, ПЗС-камеру и микроскоп, работающие в темных условиях. Поместите препарат среза сетчатки на предметное столико микроскопа с помощью инфракрасного зрителя. После того, как он будет обездвижен, начинают непрерывную перфузию.

Установите температуру перфузии на уровне от 33 до 37 градусов по Цельсию. Просмотрите поверхность среза с помощью ПЗС-камеры. Сосредоточьтесь на целевом местоположении.

Если типы целевых клеток находятся в наличии, выберите здоровую клетку для записи патч-клата. После того, как здоровая клетка будет идентифицирована, поместите записывающую пипетку в держатель для пипеток и перейдите к подготовке среза. Когда он приблизится к подготовке среза, найдите кончик пипетки с помощью микроскопа.

Как только наконечник пипетки станет виден под микроскопом, переместите наконечник вниз по направлению к целевой клетке. Далее установите усилитель и отрегулируйте пипетку на пика усилителя. Пять вольт на ампер Nana.

Запустите непрерывный электрический импульс с частотой около пяти милливольт и частотой около 10 Гц и проверьте сопротивление пипетки. Идеальное сопротивление составляет от пяти до 12 мегаом. Для большинства нейронов сетчатки.

Когда все будет готово, используйте мундштук или шприц для выдувания внутреннего раствора до тех пор, пока кончик пипетки не окажется на поверхности целевой клетки. Когда положительное давление сделает небольшую ямочку на поверхности клетки, немного придвиньте кончик вперед и прекратите выдувание. Если сопротивление пипетки постоянно увеличивается, оставьте его и следите за сопротивлением, пока оно не достигнет более одного гигаома.

Если сопротивление самопроизвольно не увеличивается, осторожно приложите отрицательное давление, пока оно не превратится в гига-уплотнение. После того, как гига-уплотнение будет достигнуто, измените удерживающий потенциал на отрицательные 70 мВ, затем периодически прикладывайте отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану внутри наконечника пипетки. Когда вся конфигурация ячейки изготовлена, сопротивление пипетки может составлять от 500 мегаом до одного гигаом, а емкостный ток является наблюдаемым.

Запишите соотношение внутривенных капельниц от отрицательных 80 до 40 милливольт. В зависимости от типа ячейки будут активированы различные типы потенциальных каналов. Наконец, при записи света вызываются синаптические токи или напряжения.

Этот препарат среза, рассматриваемый с 10-кратным увеличением, показывает как фоторецепторы, так и ганглиозные клетки без отрыва от фильтровальной бумаги. Когда этот препарат рассматривается с объективом 60x, каждый слой клеток четко виден. Свет, вызванный возбуждающими постсинаптическими потенциалами от нейронов сетчатки, был вызван в ответ на ступенчатый свет.

Амплитуда пика и время затухания варьируются в зависимости от типа и подтипа клетки. Тип клетки и ее морфологический подтип были выявлены путем мечения серой после физиологических записей После ее развития. Этот метод проложил путь ученым в области исследований сетчатки для изучения функций естественной визуальной сигнализации, а также вклада синаптических механизмов.