Прямая визуализация мышиный Спинной Cochlear Nucleus для Optogenetic стимуляции слухового пути

Общая цель этой процедуры заключается в хирургическом доступе к кохлеарному ядру в мышиной модели для проведения экспериментов, основанных на оптогенетике. Это достигается путем предварительной подготовки мыши к трепанации черепа и втягивания кожи, мягких тканей и мышц, расположенных над кожей головы с бокового расположения. В качестве второго шага проводится трепанация черепа на левой межтеменной кости, примерно на два миллиметра прилегающей к линии лямбда-шва.

Эта область залегает над кохлеарным ядром. Затем с помощью пяти французских отсасывающих трубок аспирируйте самую латеральную часть левого мозжечка, расположенную над DCN. В результате обеспечивается беспрепятственный обзор DCN.

Основные преимущества этого метода по сравнению с вспомогательными методами, такими как стереотаксическое наведение, заключаются как в достижении прямой визуализации кохлеарного ядра, так и в размещении нейро-симулятора, такого как источник света или электродная решетка, на поверхности ствола мозга. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы как в области оптогенетики, так и в области слуха. Ни один протез, такой как перенос генов, не может позволить стимулировать слуховой ствол мозга светом с достаточным лицевым и височным разрешением.

После обезболивания мыши кетамином и ксилазином путем внутрибрюшинного введения проверьте рефлекс отмены защемления пальца ноги и контролируйте частоту сердечных сокращений и дыхания, чтобы подтвердить надлежащую анестезию. Затем нанесите ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость. Далее сбрейте волосы, лежащие над кожей головы, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к месту операции.

После этого поместите мышь в маленький зверьковый стереотаксический держатель. Отрегулируйте зажим для рыла так, чтобы он был достаточно свободным, чтобы обеспечить достаточное дыхание, но достаточно плотным, чтобы полностью обездвижить голову мыши. Под микроскопом сделайте вертикальный разрез через кожу, начиная от средней линии непосредственно между ушной раковиной и продолжая до зубчатой части затылка.

Затем сместите кожу в сторону. Удалите мышцы, расположенные над левыми теменными, межтеменными и затылочными костями черепа, с помощью скальпеля или ножниц по радужной оболочке. Тем временем сведите к минимуму кровотечение, слегка надавливая аппликатором с ватным наконечником на 10-15 секунд.

Далее определите линии сагиттального и лямбда-швов. С помощью пары драгоценностей Рон. Сделайте трепанацию черепа на левой межтеменной кости примерно на два миллиметра прижмите к линии лямбда-шва.

Эта область перекрывает DCN после трепанации черепа. Следует соблюдать тонкий слой твердой мозговой оболочки, который покрывает мозжечок, аккуратно удалить его с помощью лезвия скальпеля. Удалите свернувшуюся кровь ватными палочками или аккуратно капните на мозжечок физиологический раствор, чтобы удалить кровь.

Затем используйте пятистороннюю аспираторную трубку для аспирации самой боковой части левого мозжечка, расположенной над DCN для помощи. При аспирации установите фокальную плоскость микроскопа на ожидаемую глубину кохлеарного ядра, чтобы улучшить визуализацию и обеспечить четкое изображение. Удалите примерно от четверти до одной трети левого мозжечка.

Основным ориентиром, примыкающим к DCN, является АМ верхнего полукруглого канала. После аспирации, дальнейшего кровотечения, накопления спинномозговой жидкости и смещения мозжечка на DCN быстро закапываются физиологический раствор в краниотомию для предотвращения свертывания крови. Используйте комбинацию мягкого промакивания зубной точкой и отсасывания, чтобы расчистить путь для прямой визуализации DCN.

После того, как ДКН станет хорошо видимым и свободным от вышележащей крови и ликвора, сделайте микроинъекцию вектора под давлением с помощью газоплотного шприца Гамильтона объемом пять микролитров. Используйте иглу 34 калибра с неглубоким скосом, чтобы свести к минимуму тупую травму и локализовать объем инъекции в DCN. Затем медленно вводите иглу с помощью микроманипулятора до тех пор, пока кончик не перестанет быть виден под поверхностью DCN.

Начните вводить 1,5 микролитра вектора. После этого медленно извлеките иглу, затем повторно приблизьте кожу и дайте мыши восстановиться в соответствии со стандартной процедурой восстановления. После двух-четырех недель заживления и инкубации с опосредованным вирусом переноса генов, повторно обезболите мышь, введенную вектором, а затем удалите рубцовую ткань над местом трепанации черепа.

После этого определите комбинацию оставшейся мозжечковой и рубцовой ткани, лежащей над DCN. Используйте пять французских отсосов для аспирации вышележащего мозжечка и рубцовой ткани. Вслед за придыханием.

Быстро нанесите физраствор в область трепанации черепа. Для предотвращения улюлюкания крови используйте комбинацию мягкого промакивания зубной точки и отсасывания, чтобы освободить путь для прямой визуализации DCN. DCN теперь доступен для экспериментов по физиологии, основанных на оптогенетике, показанных здесь, путем размещения лазерного волокна непосредственно на поверхности DCN, что позволяет проводить оптическую стимуляцию зараженной опсином серией импульсов синего света DCNA на поверхности инфицированного DCN, что приводит к оптически управляемому слуховому ответу ствола мозга.

С помощью микроманипулятора оптическое волокно, сопряженное с лазером синего света, помещается непосредственно на поверхность кохлеарного ядра и включается. Здесь мы можем идентифицировать импульсный синий свет на поверхности кохлеарного ядра. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как электрическое моделирование ядра, что позволяет нам напрямую сравнивать не только акустически вызванные нейронные реакции, но и электрически вызванные нейронные реакции с реакциями, вызванными оптическим моделированием.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовиться и выполнять трепанацию черепа и аспирацию мозжечка с конечной целью прямой визуализации и доступа к кохлеарному ядру.