Многогранная Преимущества белка ко-экспрессия в Кишечная палочка

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы экспрессировать coex различные белки в esia coli и оценить их сборку in vivo. Это достигается за счет использования двух совместимых плазмид, P bad и P good to co transform e coli top 10. В качестве второго этапа котрансформированный штамм культивируют при 30 градусах Цельсия, а затем индуцируют к сверхэкспрессии белков.

Затем растворимые белки экстрагируют и подвергают гелевой фильтрации с целью определения ассоциации сверхэкспрессированных белков. Полученные результаты показывают, что коэкспрессия в кишечной палочке является эффективным инструментом для производства белковых комплексов, собранных in vivo, и удобна для обхода плохой растворимости свободных субъединиц белка. Экспрессия Coex является мощным инструментом в биохимии, позволяя сверхэкспрессии различных белков в отдельных клетках идти в обратном направлении.

Можно признать, что сверхэкспрессия отдельных генов была важна для изучения белков числа Лопи. Однако, когда проблема заключалась в изучении белковых комплексов, необходимо было сверхэкспрессировать, выделять и восстанавливать in vitro отдельные отдельные белки. Это интенсивный лабораторный подход, который также подразумевает, что выход интересующего белкового комплекса ниже, чем у отдельных белков, собранных в белковый комплекс.

Кроме того, можно столкнуться с проблемой того, что один из белковых интеракторов отличается низкой растворимостью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биохимической области, такие как характеристика белковых комплексов, состоящих из множества различных субъединиц. Чтобы начать эксперимент, подготовьте электрокомпетентные клетки из топ-10 штамма кишечной палочки.

Переведите одну колонию в один миллилитр LB среды. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 180 об/мин. Разбавьте предварительную культуру от 1 до 500 в 25 миллилитрах свежей среды LB и инкубируйте культуру при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока она не достигнет логарифмической фазы 0,6 OD, центрифугируйте клеточную суспензию при 5000 об/мин в течение 20 минут после центрифугирования.

Резус, суспензию гранул в 25 миллилитров 10% объема на объем, лед, холод, стериль, глицерин воды. И повторите этот шаг четыре раза. Имея объем суспензии Resus каждый раз до достижения 1,5 миллилитров.

Далее суспендируйте гранулу в 10% глицерине и разделите клеточную суспензию на 50 микролитров аликвот. Храните аликвоты при температуре минус 80 градусов Цельсия до шести месяцев. Чтобы продолжить эксперимент, растворите нужную плазмиду в стерильной воде, дополненной 0,5 миллимолярной ЭДТА, и разморозьте аликвоту электрокомпетентных клеток на льду.

Добавьте от 2,5 до пяти нанограммов вектора и перемешайте размороженные клетки. Выдайте клетки ветеринару размером 0,1 сантиметра. Подайте на ячейки импульс мощностью 1,8 киловольта и немедленно переведите электропорированные ячейки в один миллилитр среды SOC.

Инкубируйте клетки во время встряхивания в течение часа, переложите 100 микролитров аликвот в чашки Петри, содержащие шнек LB и антибиотик, и инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Очистите Т, нанеся полосы на отдельные колонии на чашки Петри стерильной петлей. Переложите небольшое количество глицеринового бульона с котрансформантами на чашку Петри, содержащую LB-среды и антибиотики.

Дайте клеточной суспензии высохнуть на чашке Петри и промокните клеточную каплю. Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После инкубации с помощью стерильной зубочистки переведите одну колонию в один миллилитр LB антибиотической среды.

Инкубируйте культуру в течение восьми часов при температуре 37 градусов Цельсия. Разведите предкультуру один к 500 в свежей среде и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15 часов. Далее добавляем один миллимоляр.

Каждый из Aose и IPTG инкубируют культуру при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух с половиной часов. Соберите ячейки и храните гранулы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Разморозьте гранулы на льду и снова суспендируйте их в буфере для лизиса.

Затем аккуратно гомогенизируйте целовую суспензию с помощью холодного стеклянного гончара. Затем обрабатывайте элементы ультразвуком на 15 Вт в течение 15 секунд, после чего следует 15-секундный интервал охлаждения. И повторите этот процесс четыре раза центрифугой.

Общее количество белка извлекается при 10 000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Для восстановления растворимой фракции. Перенесите 20 микролитров каждого растворимого белкового экстракта в микроцентрифужную пробирку, содержащую 80 микролитров загрузочного буфера, и прокипятите раствор в течение пяти минут, чтобы проанализировать каждый растворимый белковый экстракт с помощью 12,5% акриламида SDS, загрузите 18 микролитров каждого образца и запустите электрофорез при напряжении 140 вольт в течение полутора часов.

После центрифугирования загрузите надосадочную жидкость в воронку букнера, оснащенную трехслойным бумажным фильтром, и примените слабый вакуум. Выбросьте гранулы, чтобы избежать чрезмерного пенообразования. Держите вакуумную колбу Эрленмейера на льду во время фильтрации.

После фильтрации проведите анализ по Брэдфорду для определения концентраций белка, уравновесьте фильтрационную колонку в водной рубашке размером 16 на 70 с 50 миллимолярным трисом, HCL 150 миллимолярным, NACL одним миллимолярным ЭДТА при pH 8. Используя петлю для отбора образцов объемом в один миллилитр, загрузите растворимый белковый экстракт в колонку. Выполняйте хроматографию со скоростью 0,6 миллилитра в минуту и поддерживайте температуру колонки на уровне четырех градусов Цельсия.

Далее соберите 0,9 миллилитровые дроби, чтобы проанализировать их по странице SDS. Перелейте по 20 микролитров каждой соответствующей фракции в микроцентрифужную пробирку, содержащую 80 микролитров загрузочного буфера, и кипятите пробирки в течение пяти минут. Загрузите по 18 микролитров каждого образца и проведите электрофорез при напряжении 140 вольт в течение 1,5 часов.

Следите за страницей SDS по анализу, три пять основных основных экзонуклеаз активности каждой фракции из 96. Микропланшет с использованием субстрата P-N-P-T-M-P оценивает активность ДНК-полимеразы с использованием ферментного анализа PPX и INT в качестве электронного переноса скипетра. Одна колония кишечной палочки топ-10, содержащая эпсилон PBA и P, хороша, один вектор эпсилона D 12 A 11 на один миллилитр среды LB, обработанной антибиотиками.

Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро разведите предкультуру один к 250 в трех колбах, содержащих 10 миллилитров свежей среды. Добавьте индукторы по одному миллимоляру арабинозы IPTG или AOSE и IPTG и инкубируйте индуцированную культуру при 37 градусах Цельсия в течение восьми часов.

Подготовьте неиндуцированные культуры. Параллельно. Соберите один миллилитр аликвот и разведите их один к 500 в новых колбах, содержащих 10 миллилитров свежей среды, дополненной или не дополненной индукторами.

Затем инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день. Повторите шаги, начиная с разведения предкультуры, и соберите один миллилитр аликвот.

Затем аликвоты помещаются в морозильную камеру. Далее определите количество поколений, которые произошли в каждой культуре. Переложите 100 микролитров соответствующей крупы, разведите посевной материал и закваскуйте на ЛБ планшеты.

Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующее утро. Посчитайте колонии на пластинах lb. Рассчитайте логарифм числа клеток, присутствующих в посевном материале или log I и в культуре в конце роста или log C и определите число поколений.

Затем центрифугируют культуру при давлении 5 000 G в течение 20 минут и ресуспендируют клетки в одном миллилитре 50 миллимолярного триса, H-C-L-P-H 7,6 50 миллимоляров, NACL до перма. В клетки добавляют две-три капли хлороформа и делают вихрь в течение 20 секунд. Наконец, определите активность глюкозы в DASE каждой аликвоты в 96.

В микропланшет скважины добавьте по 100 микролитров проницаемых ячеек и по 100 микролитров с использованием подложки из нитрофенола и глюкозида в каждую лунку, при этом не допуская образования пузырьков воздуха в лунках. Считывайте поглощение на 420 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов и фильтра. Кроме того, была проведена страница SDS из экстрактов общего белка, выделенных из клеток, не индуцированных и не индуцированных к сверхэкспрессии альфа, Dr.Epsilon или альфа Dr.And epsilon.

Гель демонстрирует, что одновременное добавление IPTG и ARABINOSE в питательные среды запускает совместную экспрессию альфа-DR. А затем из клеток были извлечены эпсилон-растворимые белки. Coex, экспрессирующий эти белки. Фильтрация геля и ферментные анализы показали, что альфа, ДР. И эпсилон, не связывающий совместную экспрессию белка, может быть использован для получения лучшего контроля мутаторных штаммов.

Активность бета-глюкозидазы была измерена в фенотипическом тесте для определения эффектов эпсилона. Д 12. Активность бета-глюкозидазы в мутагенных вариантах была приобретена примерно через 20 поколений, когда субъединица эпсилона дикого типа индуцировалась отдельно или в сочетании с D 12.

Вариант активности бета-глюка был приобретен кишечной палочкой в умеренных количествах. Во время этой процедуры важно проверить условия коэкспрессии. В частности, важно помнить, что есть несколько основных параметров, которые заслуживают внимания.

Во-первых, температура индукции. Во-вторых, концентрация индуктора, и в-третьих, длина индукции. Наконец, также может быть важно тестировать различные штаммы хозяев параллельно.

Так как это может колоссально повлиять на конечный выход интересующего белкового комплекса.