Обнаружение Exosomal Biomarker электрическим полем индуцированного выбросов и измерений (EFIRM)

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном выделении экзосом из биожидкостей, высвобождении их содержимого и быстром анализе этого содержимого. Это достигается путем первоначального выделения экзосом из биожидкостей с использованием магнитных микрочастиц с антителами к маркерам экзосом, с последующим нанесением выделенных экзосом на поверхность электрода. Затем экзосомы подвергаются лизису под воздействием электрического поля, и содержимое экзосом гибридизуется с зондами на поверхности электрода.

К системе также гибридизируют репортерную молекулу. Заключительным этапом является нанесение раствора субстрата на поверхность электрода с последующим получением показаний путем измерения электрического тока. В конечном итоге электрохимическое измерение тока используется для определения количества нуклеиновых кислот или содержания белков в образце экзосом.

Основным преимуществом данной технологии перед существующими методами, такими как ультрацентрифугирование и лизисный буфер, является то, что она представляет собой простой и быстрый способ выделения и анализа содержимого экзосом. Мы воодушевлены этой технологией, так как впервые эта эффективная методика позволяет нам использовать информацию, которая выделяется органами при патологиях или в норме, поступает из органа-источника через сосудистую систему и попадает в ротовую полость. Данная технология позволяет нам захватывать эту информацию и высвобождать молекулярное содержимое, которое мы можем обнаруживать одновременно и гибко.

Данная информация позволяет дифференцировать заболевание. Как правило, пользователи, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку работа с магнитными микрочастицами требует предельной осторожности. Кроме того, использование электрохимических методов при анализе биологических образцов может быть новым подходом для некоторых специалистов. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как освоить работу с магнитными микрочастицами и их нанесение на электроды довольно сложно. Необходимо соблюдать особую осторожность при обращении с магнитными микрочастицами и их нанесении на электроды.

Для начала ресуспендируйте стоковый раствор магнитных микрочастиц, покрытых стрептавидином, с концентрацией 10 µg/mL, и добавьте 5 µL этого раствора в микроцентрифужную пробирку, содержащую 495 µL PBS, для промывки частиц. Сначала установите пробирку на магнитный штатив на одну минуту и осторожно удалите буфер, не задевая частицы.

Затем перенесите пробирку в немагнитный штатив. Добавьте 500 µL PBS и промойте бусины с помощью ПЭТ. Повторите эту процедуру всего три раза, после чего используйте финальную промывку.

Суспендируйте бусины в 490 µL PBS, затем добавьте 5 µL биотинилированных мышиных антител к человеческому CD 63 из стокового раствора с концентрацией 1 mg/mL. Перемешайте раствор путем пипетирования; запрограммируйте ротатор образцов на реципрокное вращение под углом 90° в течение пяти секунд и вибрацию под углом 5° в течение одной секунды. Поместите пробирки в ротатор и запустите программу на 30 минут при комнатной температуре.

Затем перенесите пробирки на магнитный штатив на пять минут. Трижды промойте гранулы 500 microliters PBS, а затем ресуспендируйте их в 490 microliters PBS, содержащего Caine. Маркируйте пробирку идентификатором образца, после чего добавьте 10 microliters образца, несколько раз пропипетировав его для перемешивания образца с гранулами, конъюгированными с антителами.

Затем перенесите пробирки в ротатор для образцов и запустите ту же программу на два часа при комнатной температуре. После этого трижды промойте микросферы 500 µL одного молярного трис-гидрохлоридного буфера. С помощью магнитной стойки экзосомы, связанные с магнитными микросферами, переносятся для предварительного нанесения на электрод.

Сначала разведите основные растворы зонда, хлорида калия и оле-мономера в дистиллированной воде. Пятипраймерный биотинилированный ДНК-зонд специфичен для мРНК GA DH. Перемешайте раствор мономера и зонда с помощью вортекса.

Используйте массив из 16 сенсорных электродов, в котором каждый отдельный электрод состоит из рабочего, вспомогательного и электрода сравнения, выполненных из чистого золота. Установите на массив электродов пластиковую лунку, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение электродов. Перенесите 60 µL раствора зонда с мономером на поверхность золотого электрода таким образом, чтобы рабочий, вспомогательный электроды и электрод сравнения были покрыты жидкостью.

Примените профиль циклического прямоугольного электрического поля, известный как поле A-C-S-W-E, для электрополимеризации мономерного зонда. Это приведет к созданию проводящего полимерного слоя на поверхности электрода. Промойте сенсор трижды дистиллированной водой, а затем высушите его потоком азота, чтобы удалить жидкость с поверхности электрода.

После функционализации электрода зондом захвата добавьте 5 µL 1 µM раствора детектирующего зонда к 495 µL раствора комплекса экзосом с магнитными частицами, затем перемешайте путем пипетирования. В данном случае зонд представляет собой конъюгированный с флуоресцеином DNA-праймер с 3'-концом, специфичный к GA dh. Разместите функционализированную матрицу электродов над матрицей магнитов, состоящей из 16 магнитов, которые выровнены по рабочим электродам сенсора.

Затем перенесите 60 µL раствора экзосом с магнитными частицами на поверхность электрода. Приложите поле A-C-S-W-E в течение 20 циклов. Высвобожденное содержимое экзосом гибрилизуется с зондом на поверхности электрода.

Промойте поверхность электрода трижды дистиллированной водой для удаления всех несвязавшихся аналитов, после чего обдуйте электрод азотом. Затем приготовьте разведение антител к флуоресцеину, конъюгированных с HRP, в соотношении от 1 к 1000 в PBS, содержащем казеин. Затем нанесите 60 µL разведения антител на поверхность электрода.

Подайте поле A-C-S-W-E на поверхность электрода для конъюгации антифлуоресцеиновых HRP-антител с детектирующим зондом. Промойте поверхность сенсора дистиллированной водой трижды для удаления избытка антител, затем продуйте электрод азотом. Далее с помощью многоканального дозатора нанесите 60 µL субстрата TMB на поверхность каждого сенсора и с помощью потенциостата измерьте ток электрода при -200 mV в течение 60 секунд.

Для получения данных по количеству captured (связанных) экзосом использовали просвечивающую электронную микроскопию, чтобы определить, связались ли экзосомы с магнитными микросферами. Гранулы размером от 70 до 100 нм, прикрепленные к микросферам, соответствуют известному размеру экзосом после лизиса электрическим полем или детергентом. Вблизи микросфер экзосомы не обнаруживаются.

мРНК GA DH в экзосомах была обнаружена с помощью метода atric readout. Количество присутствующей GA DH со временем снижается, как и ожидалось, при лизисе экзосом электрическим полем или детергентом, что указывает на воздействие вневезикулярной среды слюны. Метод Efim использовался для измерения экзосомального содержимого сыворотки и слюны мышей, которым были введены клетки рака легкого человека, экспрессирующие экзосомальный маркер человеческого CD 63 GFP.

Через 20 дней более высокие уровни CD 63 GFP были обнаружены как в сыворотке крови, так и в слюне мышей, которым вводили раковые клетки, но не у мышей, которым вводили физиологический раствор. При выполнении этой процедуры важно помнить следующее: избегайте прикосновений к микросферам при извлечении достаточного количества жидкости во время их промывки, чтобы равномерно очистить поверхность электрода, и правильно наносите образцы на электрод. Данная технология, эта технология efim, обеспечила решение критически важной задачи по определению того, как системное заболевание в дистальном органе может передавать информацию и аккумулировать ее в таких структурах, как экзосомы.

То, как они попадают в слюну, в нашу ротовую полость, и как становится возможным захватывать экзосомы, высвобождать эти молекулярные мишени и обеспечивать их одновременное обнаружение для диагностики таких опасных заболеваний, как диабет, рак поджелудочной железы или другие жизнеугрожающие расстройства. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро экстрагировать экзосомы из биожидкости, как высвобождать содержимое экзосом и как оперативно анализировать это содержимое с помощью интегрированной электродной системы.