Разработка ингибиторов белок-белковых взаимодействий через REPLACE: Приложение к проектированию и развитию Номера ATP Конкурсная CDK ингибиторов
October 26th, 2015
Мы описываем реализацию стратегии REPLACE для нацеливания на белок-белковые взаимодействия. REPLACE — это итеративная стратегия, включающая синтетические и вычислительные подходы для преобразования оптимизированных пептидных ингибиторов в молекулы, подобные лекарствам.
Общая цель стратегии заключается в создании эффективного низкомолекулярного лекарственного терапевтического средства путем преобразования пептидного ингибитора белкового взаимодействия. Это достигается путем установления взаимосвязи между структурной активностью для желаемого взаимодействия пептидных белков, чтобы понять, какие части могут быть эффективно заменены в качестве второго шага. Вычислительная химия используется для выявления жизнеспособных альтернатив фрагментам для известных пептидных детерминант, которые затем могут быть использованы для синтеза библиотеки фрагментных пептидных гибридов.
Затем между этими фрагментами и усеченным пептидом синтезируется библиотека гибридов с целью получения молекул, которые могут быть протестированы в анализе in vitro для идентификации молекул, более похожих на лекарственные препараты и повторяющих активность нативного пептида. Результаты показывают, что с помощью методологии можно идентифицировать больше лекарственных соединений, и они представляют собой эффективные отправные точки для открытия ингибиторов белковых взаимодействий. Таким образом, основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как высокопроизводительный скрининг, заключается в том, что тракция белкового белка чрезвычайно сложна с точки зрения разработки лекарств, а традиционные методы не работают хорошо.
Стратегия замены включает в себя поэтапный итеративный подход и поэтому может занять больше времени или с большей вероятностью будет эффективной в долгосрочной перспективе. Сегодня я продемонстрирую большинство процедур сам с некоторой помощью моего коллеги, доктора Сандры Крейг, которая настроит некоторые реакции и процедуры. Начните эту процедуру с валидации протокола стыковки, за которой следует подготовка сайта связывания рецептора и лигандов, как описано в текстовом протоколе, для стыковки лигандов в бороздку циклина.
Во-первых, выберите процедуру подгонки лиганда из заданного программным обеспечением протокола взаимодействия лигандов рецептора, используйте рецептор и подготовленные лиганды в качестве входных данных для этого протокола. Для этих прогонов выберите PLP one в качестве энергосети. Энергетическая решетка, используемая программой стыковки, представляет собой силовое поле для генерации взаимодействий рецепторов лиганда и потенциальных поз.
Первый из них — это линейный потенциал, который отдает приоритет взаимодействиям водородных связей. Укажите, что энергия поз должна быть сведена к минимуму, а количество создаваемых поз равно 10. Сначала оставьте все остальные параметры на значениях по умолчанию.
Отобразите позы в программе визуализатора, а затем отсортируйте по убыванию значений PLP one score. Используйте скоринговые функции, такие как plp, для оценки аффинности связывания докированного лиганда на основе позиции потенциального лиганда, геометрии и нековалентного взаимодействия со структурой рецептора-мишени. Визуально проанализируйте первые 25% набранных поз на супер невозможность с известной группой каппинга.
Также обратите внимание на то, выполнены ли в позе фильтры взаимодействия, которые настроены на включение атомных ограничений, требующих межмолекулярных контактов, о которых известно, что они имеют решающее значение для связывания, и или которые необходимы для размещения потенциальной капсульной группы в правильной геометрии для образования амидных связей. Наконец, изучите позы на предмет визуальной комплементарности, которая определяется как эффективное заполнение связывающего кармана способом, соответствующим известной структурной активности. Взаимосвязи для синтеза торцевых укупорочных групп, использования всех коммерческих исходных материалов, растворителей и реагентов и синтеза с помощью традиционной синтетической органической химии.
Проведите тонкослойную хроматографию или ТСХ на силикагеле для мониторинга реакций путем предварительного растворения исходного материала и реакционной смеси в подвижной фазе. Затем с помощью капиллярных трубок нанесите растворенный исходный материал и реакционную смесь на пластину TLC. Поместите пластину TLC в камеру, содержащую подвижную фазу.
Как только подвижная фаза достигнет 90% пластины TLC, снимите пластину и высушите ее на воздухе. Используйте ультрафиолетовое излучение для обнаружения исходного материала и реакционных смесей в виде видимых пятен. Затем рассчитайте RF для каждой точки, который представляет собой отношение расстояния, пройденного точкой и подвижной фазой.
Затем поместите реакционную смесь в разделительную воронку и промойте ее водным кислотой или раствором основания, в зависимости от обстоятельств. Соберите органический растворитель и выпарите его в ротационном испарителе перед сушкой. Сырой продукт, полученный под вакуумом, растворяют 500 миллиграммов сырого продукта в трех-пяти миллилитрах подходящего растворителя и добавляют к образцу диоксида кремния или RP 18 перед сушкой на воздухе, помещают в него образец, содержащий сырой продукт, в диоксид кремния, переворачивают фазы в картриджи.
Очистите сырой материал с помощью автоматизированной высокоэффективной флэш-хроматографии. С помощью застежки 100 грамм столбик с градиентом. Прогон по 15 колоночным томам.
Очищенный продукт, собранный в растворителе, высушить методом флэш-хроматографии с помощью ротационного испарителя, выпарив весь растворитель до полного высыхания. Затем дополнительно высушите изделие под вакуумом, чтобы удалить все остатки растворителей. Выполните определение характеристик очищенного продукта с помощью ЯМР-МС и аналитической ВЭЖХ, как описано в текстовом протоколе, для синтеза фрагмента с торцевой крышкой, лигированных ингибиторных пептидов или сборки флипов.
Окончание пептических соединений стандартными методами твердофазного синтеза. Активируйте пять эквивалентов концевой аминокислоты С в 4,4 эквивалентах HBTU в двух миллилитрах ДИМЕТИЛФОРМАМИДА или ДМФА в течение пяти минут. Загрузите смесь на смолу катка, используя шесть эквивалентов диизопропилэтиламина, в течение одного часа при комнатной температуре.
Удалите защитную группу FM из остатков клеммы C, используя 20% INE в трех миллилитрах DMF в течение 10 минут. Соединяйте последующие аминокислоты шаг за шагом на каждом этапе. Соедините пять эквивалентов следующей аминокислоты, используя шесть эквивалентов изопропила DI, этиламина и 4,4 эквивалента HBTU в двух миллилитрах ДМФА в течение одного часа.
При комнатной температуре применяйте циклы стирки после аминокислотного соединения и этапы защиты FM D после сборки пептида. Пара N капсулирует группы с использованием шести эквивалентов изопропила, этиламина и 4,4 эквивалента HBTU в двух миллилитрах ДМФА в течение одного часа при комнатной температуре после завершения сборки пептида. Обработайте реакционную смесь двумя миллилитрами смеси для расщепления на ночь, чтобы удалить боковую цепь, защитные группы и флипы Клеве из смолы тритовать полученный продукт холодным датиловым эфиром до осаждения и при необходимости сконцентрировать в ротационном испарителе полученное твердое вещество и высушить под вакуумом или сублимационно с помощью лиофилизатора.
На этом этапе приступают к анализу флуоресцентного поляризационного связывания, как описано в текстовом протоколе для определения конкурентного связывания. Показана модельная структура H-A-K-R-R-L-I-F, связанного с канавкой для связывания циклона. Велосипедная канавка состоит из двух гидрофобных карманов, большего первичного кармана и меньшего вторичного кармана, которые перекрываются кислотными остатками, обозначенными красным цветом.
Другие важные взаимодействия включают контакты водородных связей пептидного остова и взаимодействие ионного спаривания трех основных остатков пептида, здесь показана схема связывания трех пяти D-C-P-T-R-L-I-F, проявляющаяся во взаимодействии водородных связей с пристыкованными атомами боковой цепи триптофана 2 17 и глутамина 2 54. Показаны позы трех репрезентативных и каппинговых групп, каждая из которых обладает водородными связями с взаимодействующими атомами фильтра триптофана 2 17 и глутамина 2 54. Как показано зелеными пунктирными линиями, фенхель поддерживает взаимодействие стены Вандера с вторичным гидрофобным карманом.
После просмотра этого видео вы будете лучше понимать, как выполнять и применять стратегию замены, превращая известный пептидный ингибитор в молекулу, более похожую на лекарство, которая подавляет вытяжение белкового белка и является отправной точкой для терапевтических разработок.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Эта статья описывает стратегию REPLACE для нацеливания на взаимодействия белок-белок, направленную на преобразование пептидных ингибиторов в молекулы, подобные лекарствам. Методология сочетает синтетические и вычислительные подходы для улучшения поиска лекарств.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Поиск лекарств
- Взаимодействия белок-белок
- Вычислительная химия
Предыстория
- Взаимодействия белок-белок являются сложными целями для поиска лекарств.
- Традиционные методы, такие как высокопроизводительное скрининговое тестирование, часто не успешны в этой области.
- Пептидные ингибиторы могут служить отправной точкой для разработки малых молекулярных терапевтических средств.
- Стратегия REPLACE направлена на улучшение свойств, подобных лекарствам, этих ингибиторов.
Цель исследования
- Создать эффективные малые молекулярные лекарства из пептидных ингибиторов.
- Установить соотношения структура-активность для взаимодействий пептид-белок.
- Определить жизнеспособные фрагментные альтернативы для известных пептидных детерминантов.
Используемые методы
- Установление соотношений структура-активность.
- Вычислительная химия для идентификации фрагментов.
- Синтез библиотеки гибридов фрагментов пептидов.
- In vitro анализы для тестирования свойств, подобных лекарствам, синтезированных молекул.
Основные результаты
- Были определены более лекарственных подобные соединения с использованием методологии REPLACE.
- Эти соединения представляют собой эффективные отправные точки для поиска лекарств.
- Апроч подходит преодолевает ограничения традиционных методов высокопроизводительного скринингового тестирования.
Выводы
- Стратегия REPLACE улучшает потенциал для разработки ингибиторов взаимодействий белок-белок.
- Этот метод предоставляет систематический подход к поиску лекарств.
- Будущие исследования могут строиться на этих находках для дальнейшего улучшения терапевтических возможностей.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
The REPLACE strategy addresses a critical bottleneck in oncology drug discovery by enabling the conversion of peptide-based protein-protein interaction inhibitors into drug-like small molecules. This approach expands the targetable space for cyclin-dependent kinases (CDKs), which are frequently deregulated in cancer and represent high-value therapeutic targets. By improving the drug-like properties of peptide inhibitors targeting the cyclin binding groove, the method supports early-stage target validation and lead identification efforts in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating the cyclin binding groove as a druggable site for selective CDK inhibition.
- Operational Value: Provides a systematic workflow for structure-activity relationship mapping to identify key residues amenable to replacement with fragment-like moieties.
- Predictive Value: Generates starting compounds with improved drug-likeness that recapitulate peptide inhibitor activity, supporting preclinical de-risking of CDK2/cyclin A interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces fragment peptide hybrid libraries suitable for in vitro fluorescence polarization binding assays to quantify competitive binding at the cyclin binding groove.
- Operational Value: Establishes a reproducible synthesis and purification protocol using standard organic chemistry techniques, enabling scalable generation of analogs.
- Assay Readiness: Delivers compounds with defined binding poses and interaction filters that can be used to establish robust, quantitative screening assays for downstream hit-to-lead campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports progression from biochemical inhibition to cellular context by yielding compounds that inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes, linking target engagement to phenotypic outcomes.
- Preclinical Alignment: Focuses on non-ATP competitive inhibition, offering a mechanistic avenue to avoid kinase domain selectivity challenges associated with ATP-competitive CDK inhibitors.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of binding mode conservation and interaction fingerprints, reducing uncertainty in target engagement prior to cellular efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The REPLACE strategy fits within the early discovery continuum, bridging peptide-based target validation and small molecule lead generation for oncology targets like CDKs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein-protein interfaces by converting peptide inhibitors into synthetically tractable, drug-like molecules.
- Screening: Enables assay-ready compound libraries with measurable binding affinity and defined structure-activity relationships for hit identification.
- Analytics: Relies on docking scores, interaction filters, and visual complementarity assessments to prioritize compounds with favorable binding geometry and non-covalent interactions.
- Translational Research: Connects biochemical binding data to functional inhibition of CDK/cyclin complexes, supporting alignment with cell-based readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, iterative framework applicable to other protein-protein interactions beyond CDKs, promoting platform-like utilization across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling structure-guided optimization of protein-protein interaction inhibitors with defined binding modes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized computational docking, fragment library synthesis, and purification protocols.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in early-stage projects by reducing reliance on empirical screening for challenging targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CDK inhibitors by providing early chemical matter with validated target engagement and improved drug-like properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational chemistry for docking protocol validation and pose analysis using energy minimization and scoring functions.
- Depends on access to standard synthetic organic chemistry infrastructure for peptide assembly, fragment ligation, and purification via flash chromatography.
- Necessitates cross-team alignment between modeling, synthesis, and assay teams to ensure consistency in fragment selection and hybrid library design.
- Involves adaptation considerations when applying the strategy to different protein-protein interfaces, particularly in defining interaction filters and capping group geometries.
- Practical limitations include the iterative nature of the approach, which may require multiple cycles of design, synthesis, and testing to achieve optimal drug-like properties.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Computational Identification of Potential Small Molecule Capping Groups
4:03
Synthesis of Potential N-capping Groups
6:25
Solid Phase Synthesis for the Generation of FLIPs
8:45
Results: Identification of More Drug-like Inhibitors of CDK2 through the Cyclin Groove
9:59
Conclusion
