Транспозонный зависимой интеграции плазмидной ДНК в субвентрикулярной зоне новорожденных мышей для генерации Novel Модели глиобластомы

Целью этой процедуры является создание новых моделей глиобластом и, в конечном итоге, разработка новых терапевтических подходов путем индуцирования образования глиобластом, содержащих специфические генетические мутации у мышей. Это достигается путем создания транспозонных плазмид, кодирующих конкретные гены, представляющие интерес. Следующими этапами являются подготовка плазмид с помощью реагента для трансфекции и введение их в боковой желудочек неонатальных мышей.

Затем поглощение в прогрессии опухоли контролируется с помощью люминесценции. Когда животных становится больше, их приносят в жертву для гистологического и иммуногистохимического анализа. Таким образом, новые глиобластомы со специфическими генетическими изменениями индуцируются в диком типе или на целевом генетическом фоне.

Эти опухоли могут быть изучены in vivo или использованы in vitro для создания новых клеточных линий, поддающихся биохимическому анализу и экспериментам по цитотоксичности с использованием химиотерапевтических агентов. Основное преимущество этой методики по сравнению с другими методами, такими как, например, ортотопические инъекции клеточной линии глиобластомы, заключается в том, что опухоли индуцируются путем злокачественной трансформации эндогенных клеток одного иммунокомпетентного животного с использованием генетических изменений, которые подбираются очень специфично. Этот процесс более точно воспроизводит этиологию заболевания человека и повторяет основные гистопатологические особенности ГБМ человека.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области нейроонкологии, например, какие драйверные мутации отвечают за индукцию различных типов мультиформной глиобластомы, классической, пренейронной, нервной химии у взрослых или при детских опухолях. Применение этого метода распространяется на терапию ГМП со времен новой химиотерапии. Лучевая иммунная терапия или ее комбинация может быть относительно быстро протестирована in vivo или in vitro с использованием этой модели.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я обсуждал ее с моим коллегой, доктором Джоном из Университета Миннесоты, который разработал первоначальную модель опухоли мозга с использованием транспонированной интеграции онкогенов, ингибитора генов-супрессоров опухолей в геномную ДНК хозяина. Я подумал, что эта методология будет очень мощной для изучения влияния новых мутаций на прогрессирование опухоли и поможет в разработке таргетной терапии рака мозга За три-четыре недели до эксперимента установите клетку для разведения мышей с одним самцом и одной самкой, включите в нее цветное пластиковое иглу, чтобы обогатить окружающую среду и увеличить шансы на спаривание. Удалите самца, как только беременность будет подтверждена, и через 18 дней после дня спаривания начните наблюдение за самкой для родов.

Убедитесь, что суррогатная мать доступна примерно во время родов. В первый послеродовой день выполните внутрижелудочковые инъекции. Приготовьте раствор для инъекций сначала Али, цитируя 20 микролитров смеси ДНК, содержащей транспонирование, на плазмиды в конечной концентрации 0,5 микрограмма ДНК на микролитр.

Далее в 20 микролитров вливают раствор ПЭИ в раствор ДНК и дают им поинкубироваться при комнатной температуре от 20 минут до часа, после чего смесь следует хранить на льду. Для инъекционной иглы прикрепите шприц объемом 10 микролитров к игле для подкожных инъекций 30 калибра, скошенной под углом 12,5 градусов. Затем присоедините шприц к микропомпе с автоматическим впрыском.

Протестируйте установку с 10 микролитрами воды и обязательно опорожните шприц. Теперь охладите неонатальную стереотаксическую стадию с помощью суспензии из сухого льда и алкоголя. Когда он остынет до двух-восьми градусов по Цельсию, приступайте к инъекциям.

Сначала обезболите щенка, положив его на лед на две минуты. Пока щенок находится на льду, загрузите в шприц раствор для инъекций. После обезболивания перенесите щенка в раму и обездвижьте его голову между покрытыми марлей ушными планками.

Убедитесь, что спинная сторона черепа горизонтальна и параллельна поверхности каркаса. Кроме того, черепные швы должны быть хорошо видны. Если голова щенка не будет обездвижена достаточно прочно, она будет двигаться во время укола.

В то же время, если он слишком сильно зажат между ушными стержнями рамки, лямбда не будет видна, а давление внутри головки приведет к вытеканию введенного раствора. Затем поднимите иглу и переместите ее на 0,8 миллиметра в сторону и на 1,5 миллиметра по счету. Затем снова опустите его, пока на коже не появятся небольшие ямочки.

Запишите координаты этого положения. Затем опустите иглу, на 1,5 миллиметра через кожу и череп в кору у бокового желудочка. Введите 0,75 микролитра в течение 90 секунд и подождите минуту, чтобы раствор рассеялся, пока вы ждете.

Следующего щенка, которому будет введена инъекция, можно обезболить. После взвешивания медленно поднимите иглу, затем перенесите щенка в место восстановления под нагревательной лампой. Время от обезболивания до прогревания должно быть менее 10 минут.

Чем быстрее, тем лучше следите за своим дыханием, а при необходимости аккуратно растирайте конечности, чтобы стимулировать дыхание. Как только щенок согреется, приобретет розовый цвет и ровное дыхание, верните его матери. Обычно это занимает от пяти до семи минут с момента инъекции.

Если вводится несколько щенков, все они должны быть восстановлены, прежде чем возвращать их матери. Если через полчаса все щенки не готовы, то верните ей половину из них, а остальные верните позже, по окончании процедуры, следите за матерью. После возвращения щенков.

Если она не реагирует на детенышей, добавьте суррогатную мать в клетку. Через 24-72 часа после инъекции контролируйте поглощение плазмид и переведите всех детенышей в шесть лунок для культуры тканей, по одному детенышу на лунку. Затем загрузите в одномиллилитровый шприц 30 миллиграммов на миллилитр люцифера в физрастворе или PBS и прикрепите иглу для подкожных инъекций 30 калибра.

Введите по 30 микролитров раствора подкожно между лопатками каждого щенка, чтобы не травмировать щенка, введите раствор под небольшую складку кожи. Немедленно переведите щенков на биолюминесцентную систему визуализации in vivo. Настройте последовательность для получения четырех последовательных изображений с интервалом в одну минуту с автоматической экспозицией, большим изгибом и диафрагмой в единицу. Позже.

Примерно через 17 дней у животных могут начать формироваться макроскопические опухоли, обнаруживаемые с помощью биолюминесценции и гистологии. Мониторинг опухолей также может занять до шести недель. Введите 100 микролитров раствора Люцифера внутрибрюшинно с помощью иглы 26 калибра.

Через три минуты обезболите животных в камере кислородной анестезии ISO с фтором и поместите животных в камеру визуализации, оснащенную конусами для диспергирования фтора ISO. Получите серию из шести изображений с интервалом в две минуты с автоматическим временем экспозиции, объединением средних значений и F-ступенью открытой диафрагмы, равной одной. Область, представляющая интерес, обычно представляет собой овал над головой, измеряется интенсивность люминесценции у каждого животного с использованием одних и тех же настроек для характеристики гистопатологических особенностей глиобластом, индуцированных SB.

С 57 черным шести неонатальным мышам вводили в P 1 плазмиду и покрывающую люциферазу в сочетании с NRA S и SV 40 большими Т-плазмидами Inod транспозонами с онкогенной ДНК. В качестве альтернативы, плазмида, кодирующая короткую шпильку P 53 с PDGF beta и репортер GFP, вводили в комбинации с NRAS. Был очевиден псевдонекроз палиса, периваскулярный и диффузный в мозг.

Паренхиматозные глиобластомы также контролировались с помощью биолюминесценции. Животные обычно поддаются опухолевой нагрузке. При достижении интенсивности люминесценции от 10 до седьмого до 10 к девятому калибруются единицы.

Медиана выживаемости животных предсказуемо зависела от комбинаций онкогенных транспозонов, вводимых в мозг новорожденного. Наиболее агрессивные опухоли индуцировались с помощью NRS и SV 40 с большим Т-антигеном de novo, опухоли характеризовались экспрессией характерных молекул. Зарождающиеся опухоли, созданные для экспрессии GFP, индуцированные SHP 53 и nras, экспрессировали маркер нейральных стволовых клеток neston, а некоторые также экспрессировали глиофибриллярный кислый белок.

Через 56 дней была обнаружена опухоль, окруженная многочисленными GFAP-положительными астроцитами. Эти опухолевые клетки экспрессировали неин, но не GFAP. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как индуцировать образование глиобластом, содержащих специфические генетические мутации, с помощью внутрижелудочковых инъекций неонатальным мышам, и как контролировать прогрессирование заболевания с помощью биолюминесценции.

В статье вы найдете подробности о том, как легко клонировать новую транс про плазмиду, кодирующую интересующие гены, а также о том, как контролировать опухоли и анализировать их с помощью гистологии и иммуногистохимии. Кроме того, вы найдете подробный метод создания новых клеточных линий глиобластомы из животных с генетически модифицированными опухолями. Мы надеемся, что эта статья поможет ускорить открытие новых методов лечения этой разрушительной болезни человека.