Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды

Общая цель данной процедуры заключается в комплексной оценке химической токсичности для зародышевой линии с использованием нематоды C. elegans. Это достигается путем первоначальной синхронизации червей путем добавления разбавленного раствора отбеливателя к популяции червей штамма C. elegans PXOL1 GFP на разных стадиях развития. На этом этапе образуется большое количество эмбрионов, защищенных от отбеливателя своей яйцевой оболочкой.

Второй этап заключается в создании синхронизированной популяции личинок первой стадии (L1) путем вылупления эмбрионов в жидкой среде без пищи. Затем черви растут до четвертой личиночной стадии (L4), после чего их подвергают воздействию интересующих химических веществ в жидкой среде в течение 65 часов. Заключительным этапом является визуализация экспрессии GFP-репортеров в эмбрионах внутри матки червей с помощью флуоресцентной микроскопии.

В конечном итоге доля GFP-положительных эмбрионов по сравнению с контролем DMSO отражает антигенность тестируемых соединений. Главным преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как модели Родина или анализы на клеточных культурах, является возможность оценки геничности и герминальной токсичности химических веществ на модели целого организма при одновременном проведении высокопроизводительного анализа. Сегодня процедуру продемонстрирует постдокторант д-р Даниэлла Перотти.

Графические черви для данной процедуры были предварительно подготовлены согласно описанию в сопровождающем тексте протокола; соберите червей GR с среды для роста нематод или чашек NGM, промыв их 1–2 мл M9 и перенеся в коническую пробирку объемом 15 мл. Дайте червям GR осесть на дно конической пробирки объемом 15 мл в течение примерно 5–10 минут. Затем удалите супернатант, не затрагивая осадок червей.

Перенесите осадок с червями в две-четыре микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку 1 мл разведенного раствора гипохлорита натрия. Инкубируйте в течение двух-трех минут при комнатной температуре. Контролируйте ход реакции под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что все черви погибли.

Не подвергайте воздействию отбеливателя более пяти минут, так как эмбрионы могут погибнуть. Соберите червей путем центрифугирования в течение одной минуты при 3000 RPM.

Удалите супернатант и добавьте один миллилитр стерильной среды M9 для нейтрализации реакции. Убедитесь, что все материалы, которые контактируют с червями после обработки гипохлоритом натрия, стерильны. Промойте червей дважды в среде M9.

Удалите супернатант и добавьте от 100 до 200 µL среды M9. С помощью стеклянной пастуральной пипетки перенесите каплю смеси червей в M9 на чистые чашки с NGM и инкубируйте их не менее 24 часов при 20 °C, чтобы эмбрионы вылупились в отсутствие пищи. Рост личинок остановится на стадии L1. Два этапа синхронизации.

Отбеливание и голодание на стадии L1 используются потому, что для максимизации количества личинок стадии L4, которые будут подвергнуты воздействию, крайне важно получить высокосинхронизированную популяцию червей. Через один день после создания синхронизированной популяции личинок стадии L1 соберите их с прозрачных чашек с NGM. Промойте чашки 1–2 мл M9 и перенесите личинок L1 в коническую пробирку объемом 15 мл.

Позвольте погибшим взрослым червям осесть на дно конической пробирки объемом 15 мл примерно в течение пяти минут. Соберите супернатант, содержащий личинок L1, в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Осадите червей путем центрифугирования в течение двух минут при 2 600 RPM.

Удалите супернатант, оставив примерно 500 µL. Определите концентрацию червей в растворе M9, подсчитав количество червей в каплях объемом 10 µL. С помощью стереомикроскопа подсчитайте червей как минимум в пяти каплях.

Доведите концентрацию червей до 20–25 особей на микролитр в среде M nine, затем внесите 50 мкл смеси червей в M nine на чашки с NGM. После посева на слой питательных бактерий OP 50 инкубируйте в течение 65 часов при 15 °C, чтобы синхронизированная популяция на стадии L1 выросла до стадии L4. В данном скрининге используется штамм CL, содержащий флуоресцентный транскрипционный репортер для выявления нарушений в зародышевой линии и индукции эмбриональной анеуплоидии.

Соберите личинок четвертой стадии (L4) с прозрачных чашек с NGM, промыв чашки одним или двумя миллилитрами M9 и перенеся их в коническую пробирку объемом 15 мл. Дайте червям L4 осесть на дно конической пробирки объемом 15 мл примерно на 5–10 минут. Затем удалите супернатант, не затрагивая осадок из червей.

Добавьте от трех до пяти миллилитров M9 и определите концентрацию червей в растворе M9, подсчитав количество червей в каплях по 10 µL. Используя стереомикроскоп, подсчитайте количество червей как минимум в пяти каплях для каждого образца. Ресуспендируйте червей в M9 до концентрации 1 червя на миллилитр.

Разбавьте ранее приготовленные бактерии OP 50 в десятикратной пропорции с помощью среды M nine. Убедитесь, что ресуспендированные бактерии достигли комнатной температуры, так как более низкие температуры влияют на развитие червей. Сначала с помощью многоканального дозатора добавьте 100 µL смеси червей в M nine в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном и объемом лунок 2 мл. Затем в каждую лунку добавьте 400 µL разбавленных бактерий OP 50.

В каждую лунку помещают по 100 червей в 500 µL. В нужные лунки добавляют 0,5 µL исследуемого химического вещества для достижения конечной концентрации 100 µM. Эта концентрация обычно используется при химическом скрининге в CL elgan; в качестве положительного контроля используют контроли с растворителем этанолом или DMSO в конечной концентрации 0,1%.

Используйте 100 micromolar без косольвента. Загерметизируйте планшет с помощью адгезивной пленки. Убедитесь, что планшет загерметизирован плотно, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между лунками.

Оберните планшет алюминиевой фольгой. Перенесите планшет в шейкер с соответствующей температурой на нужное время. Поддерживайте температуру в помещении около 20 °C, так как температура влияет на рост червей по завершении химического воздействия в шейкере.

Оставьте 96-луночные планшеты на 10–15 минут, чтобы взрослые особи червей осели на дно лунок. С помощью многоканального дозатора удалите 350 µL среды M9 из каждой лунки, стараясь не потревожить червей на дне планшета. Промойте червей 1 mL среды M9 и снова оставьте планшет на 10–15 минут для осаждения взрослых особей на дно.

Удалите один миллилитр M9 из каждой лунки, стараясь не потревожить червей на дне планшета. Ресуспендируйте червей в оставшемся объеме M9. Соберите 100 µL смеси червей с M9 из 96-луночного планшета и перенесите ее в лунки 384-луночного планшета с черными стенками и прозрачным дном.

Повторите этот процесс с червями из четырех 96-луночных планшетов, пока все лунки 384-луночного планшета не будут заполнены. Важно, чтобы во всех лунках был одинаковый объем, для повышения эффективности и скорости автофокусировки во время процесса получения изображений. Затем добавьте один µL lale в каждую лунку и инкубируйте червей примерно 30 минут.

Lale действует как агонист ацетилхолиновых рецепторов и иммобилизирует червей; перенесите планшет на широкопольный микроскоп высокого разрешения с возможностью автоматизированной визуализации. Используйте программное обеспечение для получения и анализа изображений высокого разрешения в соответствии с инструкциями производителя. Выберите объектив с четырехкратным увеличением для получения одного изображения на каждого червя.

Установите параметры визуализации GFP: время экспозиции — 45 миллисекунд, разрешение изображения — 2160 на 2160. Начните сбор данных; визуализация подвергнутых воздействию червей проводится непосредственно в 96-луночных планшетах. Для каждой лунки подсчитывается количество червей, содержащих хотя бы один GFP-положительный эмбрион, и нормализуется по общему числу червей в этой лунке, как показано здесь.

Воздействие химических агентов, таких как яд для микротрубочек no-code AOL, приводит к индукции высокой доли эмбрионов, экспрессирующих GFP, по сравнению с контролем DMSO. GFP-положительные эмбрионы значительно ярче, чем слабый фоновый флуоресцентный сигнал, наблюдаемый в других эмбрионах, а также автофлуоресценция, наблюдаемая в кишечнике животных. Красная стрелка указывает на GFP-положительные эмбрионы, которые отчетливо видны в матке червя, подвергнутого воздействию no-code AOL.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как окрашивание ДНК червей, чтобы более детально изучить воздействие химических веществ на зародышевую линию. Этот метод позволяет исследователям в области токсикологии быстро оценить репродуктивную и герминальную токсичность химических соединений.