Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды Caenorhabditis Элеганс

Общая цель этой процедуры заключается в всесторонней оценке химической токсичности зародышевой линии с использованием нематоды C No Haitis elgan. Это достигается путем предварительной синхронизации червей путем добавления разбавленного раствора отбеливателя к популяции червей смешанной стадии штамма C Elgan PXOL one GFP. На этом этапе создается большое количество эмбрионов, защищенных от отбеливателя яичной скорлупой.

Второй шаг заключается в создании синхронизированной популяции личинок L one, позволяя эмбрионам вылупиться в жидкости без пищи. Затем черви вырастают до четвертой личиночной стадии или L 4, после чего они подвергаются воздействию химических веществ, представляющих интерес в жидкости, в течение 65 часов. Заключительным этапом является визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии экспрессии репортеров GFP в эмбрионах внутри матки червей.

В конечном счете, доля GFP-положительных эмбрионов по сравнению с контролем ДМСО отражает антигенность тестируемых соединений. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как модели Родена или анализы клеточных культур, заключается в том, что мы можем оценить генность и токсичность зародышевой линии химических веществ на всей животной модели, в то же время выполняя высокопроизводительный анализ. Сегодня будет постдокторант доктор Даниэлла Перотти.

Графических червей для этой процедуры предварительно подготавливают, как описано в сопроводительном тексте протокола, собирают червей GR из среды роста нематоды или планшетов NGM, промывая их одним-двумя миллилитрами М девяти и перенося в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Дайте червю GR отложиться на дно конической трубки объемом 15 миллилитров примерно на пять-10 минут. Далее удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу от червя.

Переложите гранулу червя в две-четыре микроцентрифуги и добавьте в каждую пробирку по одному миллилитру разбавленного раствора отбеливателя. Выдерживать две-три минуты при комнатной температуре. Следите за ходом реакции под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что все черви мертвы.

Не отбеливайте дольше пяти минут, так как эмбрионы могут погибнуть. Соберите червей методом центрифузии в течение одной минуты. При 3000 об/мин.

Снимите супернат и добавьте один миллилитр стерильного М девяти для нейтрализации реакции. Убедитесь, что все материалы, контактирующие с червями после обработки отбеливателем, стерильны. Дважды промойте червей фильтрующим материалом М девять.

Удалите надосадочную жидкость и добавьте М девять до 100-200 микролитров. С помощью стеклянной пастбищной пипетки добавьте каплю червячной смеси M Nine для очистки тарелок NGM и инкубируйте их не менее 24 часов при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы эмбрионы могли вылупиться без пищи. Рост личинок будет остановлен на L одном этапе Два шага синхронизации.

Обесцвечивание и L-словесное голодание используются, потому что крайне важно достичь высокосинхронной теплой популяции, чтобы максимизировать количество личинок L-4, которые будут использоваться для воздействия. Через день после создания синхронизированной популяции личинок L one соберите личинки L one из прозрачных планшетов NGM. Вымойте пластины одним-двумя миллилитрами М девяти и перенесите личинок L one в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Дайте мертвым взрослым червям отложиться на дно конической трубки объемом 15 миллилитров в течение примерно пяти минут. Соберите надосадочную жидкость там, где находятся L-1 черви, в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Осаждайте червей путем центрирования в течение двух минут при 2 600 об/мин.

Удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 500 микролитров. Определяют концентрацию глистов в растворе М девяти, подсчитывая количество червей в каплях 10 микролитров. С помощью стереомикроскопа насчет не менее пяти капель.

Отрегулируйте концентрацию червей до 20-25 червей на микролитр в М 9, а затем добавьте 50 микролитров червячной смеси М девять в тарелки NGM. Сидя с OP 50, питающиеся бактерии инкубируются в течение 65 часов при 15 градусах Цельсия, чтобы позволить популяции L one синхронизироваться до тех пор, пока они не достигнут стадии L 4. В этом скрининге используется КЛ против штамма, который содержит флуоресцентный транскрипционный репортер для обнаружения разрушения зародышевой линии и индукции эмбриональной анеуплоидии.

Соберите четыре личинки L из прозрачных пластин NGM, промыв пластины одним-двумя миллилитрами M nine и перенеся их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Дайте червю L четыре отложиться на дно конической трубки объемом 15 миллилитров примерно на пять-10 минут. Затем удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы червя.

Добавьте от трех до пяти миллилитров М девяти и определите концентрацию червей в растворе М девять, подсчитав количество червей в 10 микролитровых каплях. С помощью стереомикроскопа подсчитайте не менее пяти капель для каждого образца. Ресуспендируйте червей в концентрации один червь на миллилитр в М девять.

Разведите ранее приготовленные бактерии ОП 50 в десять раз с М девятью. Убедитесь, что ресуспендированные бактерии достигают комнатной температуры, потому что более низкие температуры влияют на развитие червя, используя многоканальную пипетку, сначала добавьте 100 микролитров смеси червя М девять в каждую лунку двухмиллилитровой пластины с круглым дном 96 лунок. Далее в конце добавьте по 400 микролитров разведенных бактерий OP 50 в каждую лунку.

В каждой лунке будет 100 червей в 500 микролитрах. Добавьте 0,5 микролитра исследуемого химиката в нужные лунки для достижения конечной концентрации 100 микромоляров. Концентрация, обычно используемая в химических экранах в CL elgan, подвергает воздействию этанола или растворителя ДМСО в конечной концентрации 0,1% в качестве положительного контроля.

Используйте 100 микромоляров без козоля. Заклейте пластину с помощью клеевой пленки. Обязательно хорошо герметизируйте пластину, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между лунками.

Оберните тарелку алюминиевой фольгой. Переложите тарелку в шейкер соответствующей температуры на подходящее время. Поддерживайте температуру в помещении на уровне около 20 градусов по Цельсию, так как температура влияет на рост червей по завершении химического воздействия в шейкере.

Дайте 96-луночным планшетам отдохнуть от 10 до 15 минут, чтобы взрослые черви могли отложиться на дно планшета с помощью многоканальной пипетки. Удалите 350 микролитров М девятки из каждой лунки, стараясь не потревожить червей на дне пластины. Промойте червей одним миллилитром M 9 и дайте пластине снова отдохнуть в течение 10-15 минут, чтобы взрослые черви осели на дно.

Извлеките по одному миллилитру М девятки из каждой лунки, стараясь не потревожить червей на дне пластины. Восстановите, подвесьте червей в оставшуюся М девять. Соберите 100 микролитров червячной смеси М девять из 96 луночной пластины и загрузите ее в лунки черной стенки прозрачной нижней 384 луночной пластины.

Повторяйте процесс с использованием червяков из 4 96 луночных планшетов до тех пор, пока не будут загружены все лунки 384 луночной пластины. Важно, чтобы все скважины имели одинаковый объем, чтобы повысить эффективность и скорость работы автофокуса в процессе получения изображения. Затем добавьте по одному микролитру лале в каждую лунку и дайте червям инкубироваться примерно 30 минут.

Lale действует как агонист ацетилхолиновых рецепторов и иммобилизует червей, перенося пластину в широкопольный микроскоп с высоким содержанием алкоголя, способный обеспечить автоматическую визуализацию. Используйте программное обеспечение для получения и анализа изображений с высоким содержанием в соответствии с рекомендациями производителя. Выберите цель four x, чтобы получить по одному изображению.

Хорошо отрегулируйте параметры изображения GFP до 45 миллисекунд экспозиции и разрешения изображения до 2160 на 2160. Начало получения изображения: обнаженные черви визуализируются непосредственно на 384-луночных планшетах. Количество червей, содержащих по крайней мере один GFP-положительный эмбрион, подсчитывается для каждой лунки и нормализуется по общему количеству червей в этой лунке, как показано здесь.

Воздействие химических веществ, таких как яд микротрубочек no-code AOL, приводит к индукции высокой доли GFP-экспрессирующих эмбрионов по сравнению с контролем ДМСО. GFP-положительные эмбрионы значительно ярче, чем слабая фоновая флуоресценция, наблюдаемая у других эмбрионов, а также аутофлуоресценция, наблюдаемая в кишечнике животных. Красная стрелка указывает на GFP-положительные эмбрионы, четко видимые в матке червя, обработанного AOL.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание ДНК червей, чтобы получить более детальное представление о влиянии химических веществ на зародышевую линию. Этот метод позволяет исследователям в области токсикологии быстро оценить репродуктивную токсичность и токсичность зародышевой линии химических веществ.