Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

Общая цель данной процедуры заключается в исследовании проницаемости гематоретинального барьера и целостности внутренней пограничной мембраны на животных моделях заболеваний сетчатки. Это достигается путем первоначального введения частиц AAV, содержащих трансген GFP, в стекловидное тело или в кровоток. Вторым этапом является забор проб крови в разные моменты времени после инъекций.

Забор крови дополняется еженедельным прижизненным исследованием глазного дна (in vivo). Заключительным этапом является проведение иммуногистохимического анализа на плоских препаратах сетчатки и криосрезах сетчатки. В конечном итоге используются конфокальная микроскопия и ПЦР для визуализации паттерна трансдукции, свидетельствующего о целостности внутренней limiting membrane (ILM), и для обнаружения частиц AAV в кровотоке, что подтверждает проницаемость гематоретинального барьера.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с нашими существующими способами является то, что метод нанесения пасты AAV предоставляет информацию о проницаемости гематоретинального барьера, которую не дают другие клетки. Значимость этой методики распространяется на генную терапию с помощью AAV, поскольку она помогает убедиться в проницаемости гематоретинального барьера для частиц AAV, позволяя таким образом избежать любых нежелательных побочных эффектов. Данный метод может дать представление о целостности внутренней пограничной мембраны в животных моделях других заболеваний сетчатки, например, у крыс с сахарным диабетом.

Идея этого метода возникла у нас после того, как мы заметили, что сетчатка нашей модели мышей с нокаутом DP 71, демонстрирующая нарушение гематоретинального барьера, трансдуцировалась более эффективно, чем сетчатка мышей дикого типа.

Начните с анестезии мышей линии C-57 black-six J. Убедитесь в отсутствии трех рефлексов: рефлекса восстановления равновесия, рефлекса отдергивания и реакции на зажим хвоста.

Исчезновение этих рефлексов подтверждает наступление анестезии. Затем расширьте зрачки, нанеся на роговицу из пипетки 5% неосинефрин и 0,5% мидриатикум. После этого используйте ветеринарную мазь, чтобы смазать глаза и предотвратить их пересыхание. Теперь наберите в одноразовый ультратонкий иглу 30-го калибра стоковый раствор, содержащий от 1 до 4 × 10¹¹ частиц AAV-GFP.

Как правило, люди, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как им необходимо выполнить максимально безопасную интравитреальную инъекцию, не задев хрусталик или сетчатку. Затем необходимо ввести одноразовую иглу сверхтонкого размера 30G через экватор, рядом с лимбом, в полость стекловидного тела. После введения иглы в глаз введите 1 µL раствора, контролируя положение иглы в центре полости стекловидного тела.

Используйте один глаз в качестве контроля для экспериментов с внутренней limiting membrane, а для экспериментов с гемато-ретинальным барьером проводите инъекции в оба глаза. После инъекции нанесите противовоспалительный и антибактериальный местные препараты в каждый инъецированный глаз. Через одну неделю расширьте зрачки с помощью неосинефрина и мидриатика и проведите исследование глазного дна с использованием фундус-камеры.

Отслеживайте экспрессию GFP, проводя наблюдения через одну неделю, две недели, один месяц и два месяца после инъекции. После извлечения глаз из эвтаназированного животного, подвергшегося инъекции, проведите диссекцию глаз, чтобы удалить хрусталик и роговицу. Затем зафиксируйте диссекированный глаз методом иммерсии в 4%paraформальдегиде в течение одного часа. Через час проведите криопротекцию глаз в 10%сахарозе в течение еще одного часа при комнатной температуре. Затем выдержите глаза в 20%сахарозе в течение двадцати минут при комнатной температуре.

Наконец, оставьте глаза в 30% растворе сахарозы на ночь при температуре четырех градусов Цельсия. На следующий день заливайте и замораживайте чашечки глаз в специальной смоле, такой как cryo-matrix. Затем с помощью криостата сделайте срезы толщиной 10 микрон и перенесите их на предметные стекла, подготовленные для замороженной ткани.

Теперь пермеабилизируйте срезы на предметных стеклах с помощью детергента в течение пяти минут. Затем проведите две короткие промывки в PBS. После этого заблокируйте глаза на один час при комнатной температуре.

Для приготовления плоских препаратов сетчатки облегчите диссекцию, зафиксировав вылупленные глаза в 4% параформальдегиде в течение 15–30 минут. Эта и последующая после диссекции фиксация должны быть выполнены надлежащим образом, так как это критически важно для сохранения флуоресценции GFP. По истечении 15–30 минут фиксации проведите диссекцию глаз, удалив роговицу и хрусталик.

Отделите сетчатку от ретинального пигментного эпителия и склеры, разрезав ткани вокруг зубчатой каймы (ora serrata) и зрительного нерва. После диссекции погрузите сетчатки в 4% раствор параформальдегида еще на 30 минут для фиксации ткани и флуоресцентного белка в трансдуцированных клетках сетчатки. После фиксации промойте образец в течение пяти минут в стерильном PBS при pH 7.4.

Затем замените PBS на блокирующий буфер и инкубируйте сетчатки в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Приступите к этапу маркировки, инкубируя образцы с первичными антителами в блокирующем буфере либо в течение четырех часов при комнатной температуре, либо в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. После нанесения первичных антител трижды промойте ткани раствором PBS, затем инкубируйте ткани с антителами, конъюгированными с Alexa Fluor, в блокирующем буфере в разведении от 1 к 500.

Инкубируйте в течение одного часа для криосрезов или двух часов для препаратов с плоским монтированием. Проводите процедуру при комнатной температуре в защищенном от света месте. После нанесения вторичных антител удалите их, промыв образец трижды в PBS, как и ранее.

Теперь сделайте разгрузочные разрезы сетчатки, чтобы ее можно было ровно закрепить на предметном стекле بحيث фоторецепторы или ганглионарные клетки сетчатки были обращены вверх. Нанесите водную среду для заключения и накройте покровным стеклом. Слайды можно хранить при температуре 4 °C до проведения конфокальной микроскопии.

Начните с создания положительного контроля для циркулирующих частиц AAV. Сначала возьмите образец крови объемом от 10 до 20 µL до введения AAV. Затем, после введения анестезии, введите 100 µL исходного вирусного раствора в кровоток.

Наиболее простым способом введения веществ в кровоток является использование пенильной вены. В данном видеофрагменте мы вводим синий краситель в качестве визуального контроля инъекции. В течение следующих трех дней продолжайте периодически брать небольшие пробы крови, после чего проведите эвтаназию мыши. Из образца ткани выделите геномную ДНК с помощью коммерческого набора; используя полученную ДНК, проведите ПЦР-амплификацию с использованием пары праймеров к GFP. Проведите 30 циклов с временем элонгации 45 секунд и температурой отжига 55 °C. Ожидалось, что профиль трансдукции вектора SHH 10 будет повышен у мышей с нокаутом DP 71. Если животная модель демонстрировала нарушения в структуре внутренней пограничной мембраны, то у мышей с нокаутом DP 71 нарушены ретинальные барьеры, что делает их полезными для сравнения: при интравитреальном введении SHH 10 у мышей с нокаутом DP 71 воздействие на глиальные клетки Мюллера происходит более эффективно.

Это указывает на дестабилизацию внутренней пограничной мембраны у данной трансгенной линии мышей по сравнению с контрольной группой дикого типа. Инъекция AAV5-GFP также продемонстрировала проницаемость внутренней пограничной мембраны. Введение AAV5 путем интравитреальной инъекции оказалось неэффективным у мышей дикого типа, однако стало высокоэффективным для доставки генов в фоторецепторы у мышей с нарушенными ретинальными барьерами, например, у мышей с делецией DP 71.

Анализ методом ПЦР показал, что гематоретинальный барьер у мышей с нокаутом DP 71 остается селективным по отношению к частицам AAV, так как в образцах их крови после интравитреальной инъекции не было обнаружено никаких следов AAV. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать аденоассоциированный вирус для проверки целостности внутренней пограничной мембраны или проницаемости гематоретинального барьера путем анализа паттерна трансдукции сетчатки или наличия частиц AAV в кровотоке.