Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Общая цель следующего эксперимента заключается в флуоресцентном штрихкодировании клеток млекопитающих для улучшения мультиплексных высокопроизводительных биологических анализов, основанных на отчетливых флуоресцентных показаниях. Для этого с помощью ретровирусных частиц стабильно экспрессируют флуоресцентные белки в клетках млекопитающих, тем самым штрих-кодируя их. Далее проводится сортировка флуоресцентных активированных клеток для получения клональных популяций со штрих-кодом.

Затем клональные популяции амплифицируют, объединяют и анализируют с помощью проточной цитометрии, чтобы подтвердить, что их можно отличить друг от друга и, следовательно, использовать одновременно. Наконец, клеточные линии со штрих-кодом преобразуются с помощью помеченного анализа. Белки и биологическая активность контролируются с помощью флуоресцентных каналов, отличных от каналов со штрих-кодом.

Результаты демонстрируют полезность флуоресцентного стержневого покрытия клеток млекопитающих для мультиплексных приложений в условиях высокой пропускной способности. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, требующими тщательной калибровки антител или красителей, заключается в том, что после создания генетически штрих-кодированных клеточных линий они не требуют дальнейших манипуляций, а поскольку интересующий белок экспрессируется в течение длительных периодов времени, они используются для дальнейшей биологической адаптации. Сочетание флуоресцентных генетически штрихкодированных клеточных линий с поверхностными анализами позволяет нам независимо исследовать биологические функции или эффекты в формате гидропропускной способности.

В нашем примере мы используем флуоресцентное генетическое покрытие для мониторинга расщепления различных вирусных субстратов при мультиплексировании. Этот анализ может быть в дальнейшем использован для исследования механизмов, участвующих в расщеплении, и для разработки высокопроизводительных лекарств. За день до трансфекции посев 10-сантиметровой пластины с 2,5 умножить на 10 до шестой клетки Phoenix GP в DMEM с 10% FBS.

Эта упаковочная клеточная линия стабильно экспрессирует белки Gag и полюса для образования ретровирусных частиц в трансе. В день трансфекции используйте светлопольный микроскоп для исследования клеток. Клетки должны быть здоровыми и прилипать к пластине в виде монослоя, который будет использоваться для трансфекции.

Далее приготовьте смесь для трансфекции ДНК до 125 микролитров сыворотки свободной. ДМЭМ. Добавьте три микрограмма гликопротеинового вектора оболочки вируса везикулярного стоматита, P-C-I-V-S-V-G, и три микрограмма вектора переноса, несущего интересующий ген флуоресцентного белка, добавьте 15 микролитров полиэфираминового реагента для трансфекции и перемешайте для получения вирусных частиц, несущих различные флуоресцентные белковые маркеры. Выполняйте каждую трансфекцию независимо с выбранным для этого маркером.

Каждую смесь инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут после инкубации трансфектировать, добавляя смесь в ячейки. Затем по каплям инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия. По желанию, по прошествии 24 часов, замените среду семью миллилитрами свежей среды.

Хотя это может улучшить здоровье клеток, это может снизить вирусную нагрузку в надосадочной жидкости. Через 48 часов после трансфекции используйте пипеттер для переноса надосадочной жидкости, содержащей частицы вируса, в 10-миллилитровый шприц. Оснащен политетрафторэтиленовым фильтром 0,20 микромола для нажатия на поршень для дозирования фильтрата в две миллилитровые микроцентрифужные пробирки.

Отложите аликвоту в два миллилитра для немедленного использования. Поместите оставшиеся вирусные снаты и аликвоты на лед и перенесите их при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы за 24 часа до трансдукции в каждую лунку из шести лунок затравки от 2,0 до 3,0 умножить на 10 до пятого адгезивных клеток здесь 2 9 3 Т-клетки используются на следующий день. Чтобы трансдуцировать адгезивные клетки, удалите имеющиеся среды из пластины.

Добавьте пять микрограммов на миллилитр полимозга к двум миллилитрам ранее собранного вирусного синуса, и осторожно добавьте смесь к клеткам. Запечатайте пластины парфюмом. Затем поместите тарелки в подвесное ведро.

Центрифугируйте при 1500 умноженных на G в течение 120 минут при 32 градусах Цельсия. После отжима инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа замените ячейки среды не менее чем на 72 часа.

Посттрансдукция. Подготовьтесь к анализу трансдуцированных клеток с помощью проточной цитометрии для количественной оценки процентной скорости трансдукции. Во-первых, используя сопоставимую клеточную линию nont transduced в качестве отрицательного контроля, убедитесь, что ворота правильно установлены в нужных каналах.

Установите параметр channel voltage таким образом, чтобы отрицательное население было ниже значения 10 до трети на каждой интересующей флуоресцентной оси. Затем установите вентили для положительной флуоресценции как события, которые выходят за рамки отрицательного контроля. Затем с помощью трансдуцированных клеток определяют процент положительного для конкретного флуоресцентного канала.

Отсортируйте клетки в конические пробирки объемом 15 миллилитров, содержащие один миллилитр 100% FBS. Затем раскрутите отсортированные популяции в подвесном ведре. Роторная центрифуга при температуре 524 раза G при 32 градусах Цельсия в течение пяти минут.

После отжима повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре свежей среды, затем засейте два раза по 10-шесть клеток в два миллилитра DMEM на шестисантиметровой пластине. При такой концентрации слияние ниже 60% и позволит расти и делиться в течение как минимум двух дней. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на несколько дней, чтобы дать время для усиления.

Клональные популяции могут быть получены либо из первоначально трансдуцированных, либо из отсортированных клеток. Сортировка узких популяций на основе выбранной флуоресценции, а не отдельных клонов на этом этапе, обеспечивает резервную популяцию для будущего отбора. Если при необходимости установите затворы для сортировки в соответствии с интересующими популяциями, убедитесь, что затворы установлены на расстоянии не менее одного логарифмического масштаба Чтобы получить различимые популяции с помощью автоматизированного блока осаждения клеток, отсортируйте отдельные ячейки на 96 луночных планшетов, обратите внимание, что в среднем на лунку будет одна ячейка.

В некоторых колодцах может не быть ячеек, а в других может быть более одного последователя. Сортируя, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее двух недель, чтобы амплифицировать отдельные клоны. Регулярно исследуйте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что растущие популяции возникают из отдельных клеток, а не из более чем одной.

Также следите за тем, чтобы клетки не разрастались по прошествии двух недель. Скрининг предполагаемых клональных популяций с помощью проточной цитометрии и сравнение их с популяцией отрицательного контроля. Истинные клональные популяции должны иметь очень плотные флуоресцентные паттерны.

Выбирайте наиболее четко обособленные популяции на основе средней интенсивности и плотности популяции. Усиливайте их по мере необходимости или храните запасы в замораживающей среде с 10% ДМСО при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение коротких периодов времени или в жидком азоте в течение более длительного времени. Затем проверить, можно ли успешно использовать клональные популяции в мультиплексной системе скрининга с высокой пропускной способностью.

Выберите набор клонов с различимой абсорбцией, спектрами излучения и/или различной интенсивностью, и объедините их в одной пробирке с затравкой. 50 000 объединенных ячеек по 200 мкм дополнены DMEM в каждой лунке 96 луночного планшета в отдельных пробирках. Подготовьте негативные и одноцветные регуляторы для использования при настройке параметров и компенсационных значений на проточном цитометре.

Установите значения компенсации. Затем проанализируйте образец, чтобы убедиться, что можно различить каждую из независимых установленных флуоресцентных клеточных линий. Чтобы адаптировать клеточные линии со штрих-кодами к биологическому применению, сначала выберите элементы анализа, которые были сконструированы таким образом, что они связаны с меткой или флуоресцентным белком в виде слияния или через внутренний сайт входа рибосом.

Ires, который обеспечивает простое обнаружение с помощью проточной цитометрии вестерн-блоттинга или микроскопии. Используемая здесь система состоит из биологического анализа, в котором белок оболочки ВИЧ экспрессируется на поверхности клетки, обнажая ее HA и флаговые метки. Белок анализа экспрессируется в клетке со штрих-кодом, которая экспрессирует TD-помидор.

Расщепление белка можно контролировать путем окрашивания антителом Anti-Flag, меченным FSE. Когда белок не расщепляется, наблюдается окрашивание, но когда белок расщепляется, зеленая флуоресцентная маркировка больше не видна. Чтобы провести биологический анализ в клетках со штрих-кодом, трансдуцируйте их вирусными частицами, содержащими элементы анализа по выбору.

Добавьте вирусный натин SUP в клетки по выбору и вращайте центрифугированием. Затем инкубируйте клетки с флуоресцентно мечеными антителами против HA. Затем отсортируйте клетки со штрих-кодом, чтобы выделить те, которые содержат элементы анализа, положительные на HA.

Наконец, объединенные четкие линии ячеек со штрих-кодом. Каждый из них содержит пробу, содержащую различную подложку. Инкубируйте смесь клеток с конъюгированными антителами Anti-Flag и ZI и проанализируйте их с помощью проточной цитометрии, чтобы определить, произошло ли расщепление белка, чтобы отследить анализ, проанализировать или расшифровать популяции в соответствующем канале, где здесь можно различить различные генетически кодированные клеточные линии.

Затем ПЭ-канал для томатов TD расшифровывает природу субстрата путем анализа в фит-канале для выявления положительной популяции для анализа на расщепление поверхностно экспрессированных белков в секреторном пути. Sub T one клетки для флуоресцентного штрих-кодирования для экспрессии TD томата и отсортированы на три популяции с разной интенсивностью. Затем каждая из популяций была трансдуцирована различным ретровирусом, чтобы индуцировать экспрессию оболочечного белка ВИЧ дикого типа, мутантного белка оболочки ВИЧ или вируса денге.

Пограничный белок PRM, каждый из которых окружен флагом и тегами HA. Трансдуцированные клетки инкубировали с антителами против HA и Anti-Flag. Окрашивание Anti-HA проводилось для подтверждения наличия сконструированного белка анализа, в то время как окрашивание Anti-Flag проводилось для определения того, был ли он расщеплен.

Когда неокрашенные комбинированные популяции были проанализированы с помощью проточной цитометрии, клональные популяции были различимы на основе штрих-кода томата TD, но неразличимы по фит-каналу. Напротив, когда одни и те же популяции были окрашены антителами к флагу, одна популяция была положительной на flagg. На основе штрих-кодирования эту популяцию можно легко идентифицировать как популяцию, несущую субстрат мутантной оболочки ВИЧ.

Теперь у вас должно быть очень хорошее представление о том, как использовать технологию ретро-клапанов в сочетании с проточной цитометрией. Для создания флуоресцентных генетически штрихкодированных клеточных линий, четырех биологических применений в мультиплексном формате. Возможность связывания флуоресцентных генетически штрих-кодированных клеток с клеточными анализами в мультиплексном формате значительно повышает высокую пропускную способность. После того, как клеточные линии сгенерированы, важно заморозить их.

Затем периодически размораживайте их, повторно анализируйте и освобождайте обратно. В то время как создание флуоресцентных генетически штрихкодированных клеточных линий поначалу может занять много времени, после их создания они значительно повышают повторяемость и надежность будущих применений.