Функциональная характеристика Na ⁺ / H ⁺ Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране

Общей целью данного эксперимента является измерение активности внутриклеточно экспрессируемых протонов натрия. Это достигается путем предварительного отбора клеток, экспрессирующих внутриклеточные протонаторы натрия на плазматической мембране, путем отбора протонов-киллеров. На втором этапе выбранные клетки подкисляются, а затем измеряется внутриклеточное восстановление рН, чтобы подтвердить активность обмена протонов натрия в клетках.

Затем измеряется быстрая кинетика переноса ионов для определения констант сродства для транспортируемого катиона и ингибиторов. В конечном счете, мониторинг изменений внутриклеточного pH и быстрой кинетики выбранных соматических клеток позволяет функционально охарактеризовать внутриклеточный белковый обмен. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как экспрессия мутантных транспортеров или использование per cells, заключается в том, что он позволяет экспрессировать внутриклеточные транспортеры белого типа на плазматической мембране, что позволяет напрямую измерять их функцию.

Демонстрировать процедуру будет доктор Мэллори поэт, научный сотрудник моей лаборатории. Во-первых, инкубируйте клетки, экспрессирующие представляющий интерес внутриклеточный протонит натрия при загрузке раствора при температуре 37 градусов Цельсия и инкубатор без углекислого газа в течение одного часа. Далее аспирируйте нагрузочный раствор и дважды промойте клетки свежей средой.

После второй промывки аспирируйте среду и инкубируйте клетки в восстановительном растворе в инкубаторе, не содержащем углекислого газа. Еще через час замените восстановительную среду обычной питательной средой и выращивайте клетки в стандартных условиях культивирования. Повторяйте этот цикл отбора два раза в неделю до тех пор, пока не появятся стабильные клоны, чтобы получить изображение внутриклеточного флуоресцентного pH клеток.

Во-первых, был установлен комплект изображений, состоящий из инвертированного микроскопа, соединенного с высокочувствительной видеокамерой с узкополосными интерференционными фильтрами 450 и 490 нанометров в паре с соответствующими кварцевыми нейтральными фильтрами для возбуждения. Если возможно, используйте соответствующий набор фильтров и условий освещения для установки сопоставимых значений флуоресценции для первого и второго каналов таким образом, чтобы отношение приближалось к единице для измерения прямой активности протонита натрия. Затем подкислите клетки с помощью часовой инкубации в растворе для загрузки аммония.

При отсутствии углекислого газа в течение последних пяти минут инкубационного окрашивания клетки с метрическим рН-чувствительным флуоресцентным соотношением погибают. В конце инкубационного периода обработайте клетки раствором для загрузки аммония, чтобы удалить внеклеточный зонд, и смонтируйте окрашенные клетки на микроскопе. Выберите области интереса, в которых будут измеряться значения флуоресценции в соответствии с требованиями.

Затем запишите несколько изображений, чтобы установить исходный уровень, и перфузируйте клетки раствором RIN, чтобы инициировать падение флуоресценции. После того как pH стабилизируется, изучите клетки с интересующим раствором, чтобы измерить скорость восстановления pH, опосредованную обменом лития-водорода, натрия-водорода или калия-водорода. Теперь изучите клетки с раствором хиппи с добавлением хлорида калия и герина.

Затем соберите результаты измерений флуоресценции по изображениям и экспортируйте данные в программу для работы с электронными таблицами в текстовом формате для измерения начальной скорости протонита натрия. В-седьмых, путем быстрого поглощения лития, подкисляют элементы и многолуночные планшеты методом загрузки имодиумом, как показано выше. Затем быстро промойте пластины дважды, как показано выше.

Затем инкубируйте клетки в поглощающих растворах, содержащих от одного до 10 микромолярного лития и желаемых концентрациях представляющего интерес катиона или ингибиторов, в течение примерно одной минуты или менее в конце периода поглощения, осторожно удалите поглощающую среду и быстро промойте клетки четыре раза ледяным PBS менее чем за 10 секунд в общей сложности, чтобы предотвратить отток лития, затем изготовьте клетки в дозе 250 микролитров 25% азотной кислоты на ну, по крайней мере, на один час. Соскабливание каждой лунки концом наконечника пипетки в конце инкубации и перенос суспензий из каждой лунки в новые микроцентрифужные пробирки. Наконец, образцы центрифуги в течение пяти минут при 15 000 G при комнатной температуре, чтобы удалить клеточный мусор, а затем измерить содержание лития в SNAT с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии.

Согласно инструкции производителя, отбор протонов для убийства основан на диффузии слабого основания аммония. Например, клетки, которые не экспрессируют функциональный протонатор натрия на плазматической мембране, не могут восстановить нейтральное значение pH и, следовательно, демонстрируют типичный подкисленный аспект с плоской формой и зернистым цитозолем, как видно на этом репрезентативном изображении после повторных циклов отбора, клетки, которые полностью и стабильно выживают. Закисление, однако, образует отдельные клеточные клоны, как показано здесь, как показано на рисунке, поскольку активность и ионная селективность внутриклеточных протонов натрия, экспрессируемых на плазматической мембране, могут быть охарактеризованы путем измерения изменений внутриклеточного pH, индуцированных в различных экспериментальных условиях, как это наблюдается на этих графиках после кислотного окисления с нагрузкой Имодия.

Что касается кинетики фермента, то реакция дозы для начальных скоростей поглощения может быть дополнительно использована для получения значений константы сродства для субстратов и для значений константы ингибитора ингибиторов. Действительно, интересной особенностью транспортеров является то, что различные катионы связи будут конкурировать за транспорт, что дает возможность измерить константу сродства для натрия путем конкуренции с поглощением лития, как показано на этом рисунке. Другие эксперименты, такие как BioInnovation на клеточной поверхности в сочетании с сайленсингом РНК, могут быть проведены для того, чтобы убедиться, что интересующий транспортер действительно экспрессируется на плазматической мембране.