Исследуя одну молекулу адгезии методом атомно-силовой микроскопии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы соединить один полимер с наконечником кантилевера A FM для проведения четырех экспериментов по спектроскопической десорбции поверхности с одной и той же молекулой несколько раз. Это достигается за счет первичной плазменной активации поверхности наконечника с целью образования гидроксильных групп в качестве второго этапа. Консольный наконечник аминоизолирован с помощью раствора для испытаний вверх, который образует аминогруппы на поверхности наконечника.

Третий шаг заключается в соединении молекул полиэтиленгликоля с аминогруппами. Они предотвращают неспецифические взаимодействия между наконечником и подложкой и служат линкерными молекулами для полимеров. Наконец, полимеры конъюгируются с молекулами полиэтиленгликоля с образованием зонда.

Измерения показывают, что эта процедура действительно позволяет использовать один и тот же полимерный силовой зонд для полного экспериментального набора, а также для многих сотен кривых силовых расстояний. Основные преимущества экспериментов с одиночными молекулами перед ансамблевыми методами заключаются в том, что можно изучать редкие подтверждения и редкие состояния, которые в противном случае были бы скрыты в ансамблевом усреднении. Из-за их небольшого размера эти эксперименты можно напрямую сравнить с молекулярно-динамическим моделированием.

Первым шагом является ковалентное присоединение молекул зонда к кончику кантилевера. Начните со свежего нитрида кремния. В консольных чипах используются чипы с постоянной пружины от 10 до 100 пиконьютонов на нанометр.

С помощью пинцета поместите их на чистое стекло или чашку Петри. Далее поместите предметное стекло с чипами в 100-ваттную плазменную камеру, предварительно вакуумировав камеру и промыв ее кислородом, работающим при давлении 0,25 миллибар и 20 ваттах, в течение 15 минут. На следующих этапах используйте вытяжку, чтобы избежать вдыхания органических паров во время плазменной обработки.

Приготовьте для аминоизоляции консоли в стеклянной чашке Петри, помещенной в 2,5 миллилитра испытуемого раствора. Кроме того, отремонтируйте сосуд, содержащий ацетон. Извлекайте консоли сразу после завершения плазменной обработки.

Окуните каждый кантилевер в ацетон на одну секунду, а затем поместите его в раствор Optus. Перед тем, как продолжить, инкубируйте консоли в течение 15 минут при комнатной температуре. По мере инкубации консолей начинайте подготовку к пегилированию, чтобы свести к минимуму воздействие воды и воздуха на компоненты.

Начните с заранее подготовленных пробирок pH, одна из которых содержит m peg, NHS и другой краситель. NHS Peg. Определите вес содержимого каждой пробирки.

Далее поработайте с пробиркой, содержащей EG NHS, и приготовьтесь добавить хлороформ. Залейте хлороформ до достижения конечной концентрации 25 миллимоляров и достаточного раствора для покрытия консолей на последующих этапах. Поместите трубку на вихревой миксер, чтобы порошок растворился.

Отложите зонд с EG NHS в сторону, чтобы работать с диетой. Привязка NHS. Добавьте хлороформ, чтобы он достиг конечной концентрации 0,25 миллимоля.

Используйте вихревой миксер, чтобы убедиться, что порошок растворился. Затем смешайте растворы, чтобы отрегулировать соотношение между диетическим NHS peg и метил-пегом NHS. Это соотношение обычно составляет один к 500.

Приобретите небольшую стеклянную чашку Петри с крышкой, чтобы ограничить испарение и заполните ее смесью в качестве консолей. Завершите инкубацию. В тестовом растворе APT имейте наготове два контейнера с примерно 10 миллилитрами ацетона и один с хлороформом для их промывки.

Опустите каждый из них в ацетон дважды и один раз в хлороформ и поместите в раствор полиэтиленгликоля. Накройте тарелку крышкой и держите консоли в растворе. В течение одного часа подготовьте для ковалентного связывания молекулу зонда, в данном случае полиаминокислоту поли-дитирозин.

Начните с объема одного моляра гидроксида натрия, растворите в этом зонде молекулу до концентрации один миллиграмм на миллилитр. Для поли-D тирозина замените гидроксид натрия на натриевое отверстие с pH от 8 до 8,5. Восемь буферов непосредственно перед функционализацией.

По завершении инкубации консолей в растворе полиэтиленгликоля подготовьте три емкости для их промывки и емкость с отверстием из политирозина. Восьмой буферный раствор для промывки – это пять миллилитров хлороформа, пять миллилитров этанола, пять миллилитров буфера канала ствола. Используйте около 300 микролитров буферного раствора политирозина.

Достаньте консоли и окуните каждую сначала в хлороформ, затем в этанол, а затем в буфер с отверстием для восьми отверстий. Перед помещением их в политирозин отверстие восьми буферных растворов. Дайте стружке консоли поинкубироваться в течение одного часа после того, как она будет готова, примерно пять миллилитров буфера для батета в одной емкости и пять миллилитров сверхчистой воды в другой для промывки консолей также имеют 20 миллилитров сверхчистой воды для их хранения.

Возьмите консоли и опустите каждую из них в буфер Boite, а затем добавьте сверхчистую воду для полоскания. Затем погрузите его в сверхчистую воду для хранения. Теперь консоли можно использовать для сбора данных.

После того как наконечник FM функционализирован, а поверхность подготовлена и смонтирована, приступайте к сбору FM-данных. Сначала поместите функционализированный кантилевер в держатель кантилевера A FM, подходящий для измерения в жидкостях. Далее подсоедините держатель кантилевера к головке A FM.

Затем налейте воду в ячейку для жидкости, чтобы погрузить консоль и поверхность. Затем опустите головку A FM на жидкостную ячейку. Дайте системе уравновеситься не менее получаса.

После э уравновешивание. Расположите консоль далеко от поверхности, затем запишите спектры теплового шума 10 или более спектров для получения достаточного отношения сигнал/шум для исключения эффектов поверхностного демпфирования. Далее осторожно подойдите к поверхности, чтобы произвести измерение обратной чувствительности оптического рычага.

Для этого необходимо прижать кончик кантилевера к твердой поверхности, чтобы зафиксировать зависимость силы от расстояния перемещения пизо. Измерьте наклон во время контакта и инвертируйте его, чтобы определить обратную чувствительность оптического рычага. Следующая работа, обратная чувствительность оптического рычага и спектры теплового шума Определите постоянную пружины кантилевера путем подгонки гармонического генератора к спектру теплового шума.

Теперь задайте соответствующие параметры для сбора данных. Записывайте многочисленные кривые принудительных расстояний для каждого экспериментального условия в конце сбора данных. Снова определите чувствительность и постоянную пружины, чтобы проверить согласованность и стабильность системы.

Этот пример принудительной трассировки расстояния красного цвета получен в результате втягивания политирозина из метилового самоорганизующегося монослоя нечистой воды. Одноступенчатое падение до нуля указывает на отрыв одной молекулы. Сигмовидная посадка показана черным цветом.

Длина извлеченного плато и сила плато обозначены стрелками. Скорость удлинения кантилевера составляла 0,5 мкм в секунду, а время пребывания на поверхности — одну секунду. Различные жидкие среды для измерения вызывали изменения силы экстрагируемого плато.

Эти гистограммы отражают извлеченную силу плато для измерений в чистой воде и измерений в воде. Смеси этанола регистрировали не менее 300 следов силового расстояния для каждого раствора с одним в одном и том же полимере. Здесь приведены аналогичные гистограммы для длины экстрагированного плато для чистой воды и в водных смесях этанола.

Добавление этанола ослабляет гидрофобное взаимодействие между политирозином и поверхностью, что приводит к снижению силы плато и уменьшению длины плато. Это обобщено в этой таблице длины пикового плато в зависимости от силы пикового плато. После освоения протокол функционализации может быть выполнен примерно через четыре часа после разработки.

Этот метод позволил исследователям в области физики и химии изучить адгезию нарушений полимеров на границах раздела.