Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса

Общая цель этой процедуры заключается в проведении глубокой стимуляции мозга переднего таламического ядра и изучении изменений экспрессии генов в гиппокампе крысы. Это достигается путем предварительного обезболивания животного. Далее животное готовят к хирургическому вмешательству.

На коже головы делается разрез, и череп обнажается. Затем в правильном положении относительно бгма проделываются отверстия для бора. Вставляются электроды DBS и проводится стимуляция.

Наконец, животное усыпляют, а мозг вскрывают. Для удаления гиппокампа ткань обрабатывается для экстракции РНК и проводится подготовка CDNA и КПЦР. В конечном счете, результаты демонстрируют, что глубокая стимуляция мозга влияет на экспрессию генов в гиппокампе крысы.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в хирургии глубокой стимуляции мозга, например, каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе терапевтического эффекта операции глубокой стимуляции мозга? Применение этого метода распространяется на терапию не только эпилепсии, но и других нейронных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и дистония. Поскольку DPS становится хирургическим подходом к лечению многих нейронных расстройств Чтобы подготовиться к операции, используйте хирургические прокладки, чтобы накрыть рабочий стол и убедиться, что есть возможность утилизации биологически опасных отходов.

Взвесьте крысу и рассчитайте дозу анестезии в соответствии с текстовым протоколом крепления и закрепите два электрода на электрододержателе стереотаксической хирургической рамки и с помощью микроскопа осмотрите наконечники электродов на предмет правильной юстировки. Закрепите электроды на расстоянии трех миллиметров друг от друга, стараясь не касаться кончика электрода твердыми поверхностями. Введите кетамин ксилазин.

Перемешайте внутрибрюшинно животному и подтвердите, что животное достигло хирургической плоскости анестезии, проверив рефлекс защемления пальца ноги, частоту дыхания, а также глубину и регулярность дыхания. Закрепите и расположите животное на стереотаксической раме. Нанесите на глаза животного глазную смазку, чтобы защитить ее от чрезмерной сухости, и продезинфицируйте кожу головы тремя чередующимися скрабами, каждый из которых содержит бетадин и либо спирт, либо стерильный физиологический раствор.

Поместите животное на циркуляционную теплую водяную подушку или используйте нагревательные лампы, чтобы поддерживать температуру тела животного на оптимальном уровне. Основываясь на атласе мозга крыс Паксоса и Уотсона, используйте следующие стереотаксические координаты для нацеливания на переднее ядро таламуса или на переднее заднее отрицательное 1,6 миллиметра. Срединный боковой 1,5 миллиметра и дорсо вентральный 5,2 миллиметра.

Затем сделайте разрез в сагиттале кожи головы, чтобы обнажить череп Используя пару ретракторов, закрепите надрезанную кожу головы, чтобы обнажить череп. Затем стерильными тампонами, смоченными в этаноле, очистите область надреза, чтобы четко обнажить швы. Найдите bgma и используйте черный маркер для рынка, чтобы определить положение отверстий бора.

Сделайте еще две отметки примерно на 1,5 миллиметра. Медиа латерально с обеих сторон от сагиттального шва и на 1,6 миллиметра позади коронарного шва. Теперь, чтобы сделать два отверстия для бора, используйте этанол для дезинфекции кончика дрели.

Используя сверло, расположенное под углом 45 градусов, просверлите отверстия бора, часто переключаясь между двумя отверстиями, чтобы избежать чрезмерного нагрева в центре любого отверстия бора. Продолжайте сверлить до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не обнажится. С помощью иглы с загнутым кончиком в форме буквы L удалите все сломанные куски кости, которые могли бы препятствовать введению электрода.

Будьте осторожны, чтобы не повредить подлежащую твердую мозговую оболочку и/или мозговую ткань при удалении костных фрагментов. Закрепите узел с двумя электродами на вращающейся рукоятке стереотаксической рамы и зафиксируйте ручку под углом 90 градусов. С помощью регулировок в стереотаксическом кадре расположите левый электрод точно над бгма.

Использование стереотаксических корректировок для носителей. Боковое позиционирование точно переместило левый электрод на 1,5 миллиметра в левую сторону bgma, так что теперь есть два электрода, идеально выровненных вдоль коронального шва, но разнесенных друг от друга. Среда толщиной 1,5 мм сбоку от BGMA.

Затем с помощью переднезадней стереотаксической коррекции переместите электроды на 1,6 миллиметра назад к коронарному шву. Затем с помощью дорсальной вентральной регулировки опустите электроды, чтобы сначала проверить, были ли отверстия бора сделаны в правильном месте, чтобы электроды можно было легко вставить, не касаясь шероховатых краев отверстий бора. Если это так, вставьте электроды на глубину 5,2 миллиметра от поверхности черепа.

Подключите электроды через провода к набору стимуляторов с частотой 130 герц, напряжением 2,5 вольта и шириной импульса 90 микросекунд. Обеспечьте высокочастотную стимуляцию в течение желаемого периода времени. Проведение односторонней или двусторонней стимуляции.

После стимуляции осторожно удалите электроды и с помощью трех нулевых швов или стерильных хирургических скоб зашить разрез, ввести бупренорфин подкожно и наблюдать за животным до тех пор, пока оно не вернется к нормальной активности, а затем вернуть его в помещение. Поместите мозг на предварительно охлажденную акриловую матрицу мозга на льду с помощью бритвенного лезвия. Разрежьте мозговую оболочку примерно в семи-восьми миллиметрах от самого переднего края мозга.

Сделайте второй надрез корли и сзади от первого среза, чтобы можно было удалить срез мозга толщиной примерно пять миллиметров. Перенесите срез мозга в чашку Петри с ледяным PBS с помощью лезвия бритвы, отрежьте два полусферических участка и обратите внимание, какой участок соответствует левой и правой сторонам соответственно. С помощью тонких щипцов и ножниц осторожно удалите вспышку гиппокампа, заморозьте ткань на сухом льду и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к последующим этапам РНК, выполненным в соответствии с показанным здесь текстовым протоколом относительных уровней экспрессии BDNF по сравнению с контрольным геном бета-актином в указанные временные точки.

После стимуляции DBS. Повышение регуляции BDNF наблюдается сразу после операции DBS, наряду с пиком экспрессии через три часа после стимуляции. Это наблюдение позволяет предположить, что повышенная экспрессия BDNF и возникающая в результате нейропротекция могут способствовать терапевтическому эффекту DBS у пациентов с эпилепсией.

Эта панель иллюстрирует экспрессию рецептора ГАМК, G-A-B-R-D, который демонстрирует повышенную экспрессию у стимулированных животных по сравнению с нестимулированной контрольной группой через три часа после DBS. Учитывая, что агонисты ГАМК используются в качестве эффективных супрессоров судорог, интересно наблюдать за усилением экспрессии G-A-B-R-D после ДБС, что указывает на возможную роль ГАМК и противоэпилептический эффект ДБС. Следуя этой процедуре.

Могут быть выполнены и другие методы, такие как западная блокада, иммунопреципитация хроматина и многие другие стандартные молекулярно-биологические анализы. Это помогает ответить на вопросы, связанные с изменениями в экспрессии белков, посттрансляционными модификациями, занятостью транскрипционного фактора в конкретных областях промотора гена и так далее. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить операцию по глубокой стимуляции мозга у крыс.

Изолируйте ткань гиппокампа и проанализируйте ее на предмет изменений экспрессии генов.