Генерация мышиный кардиостимулятор клеточных агрегатов на основе ES-Cell-программирования в комбинации с Myh6-промоутер-Selection

Общей целью этой процедуры является получение высокочистых клеток синусового узла. Это достигается путем индуцирования дифференцировки клеток путем модификации среды и создания висячих капель, которые приводят к формированию эмбриональных тел определенного размера. Затем тела эмбрионов усаживают на чашку, покрытую желатином, чтобы они образовали клеточный слой.

Затем инициируется подбор антибиотика, и выживают только кардиомиоциты. Наконец, клеточный слой диссоциируют для получения быстро бьющихся одиночных синусовых узловых клеток или небольших синусовых узловых телец. В конечном счете, визуализация живых клеток используется для отображения высоких частот биения клеток синусового узла.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно получить высокочистые синусовые узловые клетки, например, для тестирования на наркотики. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о заболевании синусовых узлов, потому что клетки дадут нам представление об основных механизмах. Технология будет представлена в лаборатории Джулией Юнг, нашим аспирантом, которая разрабатывает метод: «Начиная с линии ES-клеток и плюрипотентных стволовых клеток, совместно культивируемых с облученными фидерными клетками, как описано в текстовом протоколе, за два дня до процедуры дифференцировки удаляются ПСК из фидерных клеток путем предварительной аспирации среды».

Используйте 10 миллилитров PBS для промывания клеток. Затем добавьте семь миллилитров раствора коллагеназы и инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее поместите стерильный фильтр 40 микрометров в пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем тщательно промойте колонии ПСХ, пипетируя раствор коллагеназы вверх и вниз пять раз. Перенесите суспензию ячеек в фильтр и используйте восемь миллилитров PBS для трехкратной промывки фильтра. Затем переверните фильтр и поместите его вверх дном в чашку Петри и нанесите пипеткой 10 миллилитров PBS на дно фильтра.

Чтобы удалить колонии ПСХ, теперь перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в течение пяти минут 300 раз. Ж. Удалите PBS, подвесьте клетки в одном миллилитре Аккутана и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации добавьте 10 миллилитров PBS.

Смешайте клеточный раствор с помощью пипетирования вверх и вниз пять раз и центрифугируйте в течение пяти минут при 300-кратном G. После удаления PBS используйте 10 миллилитров среды для культивирования клеток, чтобы повторно суспендировать клетки и определить количество клеток затравки. 15 000 клеток на квадратный сантиметр в фильтрующей колбе площадью 75 квадратных сантиметров и выращивайте их в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, когда колба должна быть 50 до 70% сливается. После забора клеток и суспендирования Resus в среде для дифференцировки в соответствии с текстовым протоколом пипеткой внесите 20 миллилитров воды и пять миллилитров висячей капли или раствора HD в квадратичную чашку Петри, чтобы избежать высыхания HDS.

Далее пипетируйте до 50 миллилитров клеточной суспензии в лоток. Затем переверните крышку чашки Петри и с помощью 12-канальной пипетки поместите на крышку по 180 HDS, содержащих по 20 микролитров клеточной суспензии. Осторожно переверните крышку и поставьте ее на чашку Петри.

После инкубации в течение двух дней, чтобы дать клеткам сформироваться EBS, осторожно переверните крышку квадратичной чашки Петри и перенесите EBS, полученную из двух чашек Петри, в 50-миллилитровую пробирку. Подождите 10 минут, чтобы EBS остыл на дно трубки, затем отасуньте как можно больше среды. Используйте 10 миллилитров дифференцирующей среды для суспензии EBS и перенесите суспензию в 10-сантиметровую чашку Петри.

После того, как клетки были культивированы в суспензии в течение четырех дней, согласно текстовому протоколу, перенести EBS в одну покрытую желатином чашку для клеточной культуры площадью 10 квадратных сантиметров и инкубировать в течение следующих двух-шести дней под микроскопом, проверить клетки на предмет бьющихся очагов и образования клеточного слоя через три дня после того, как клетки начали биться, Аспирируйте среду и добавьте 10 миллилитров свежей дифференцировки. Среда, содержащая 400 мкг на миллилитр G, поступает в клетки через четыре дня. Осторожно удалите среду, не отсасывая клеточный слой.

Затем добавьте 10 миллилитров PBS для промывания клеток. После тщательного удаления PBS добавьте 10 миллилитров раствора коллагеназы четыре и переложите клетки в 50 миллилитровую пробирку. Затем, после инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, энергично перемешайте суспензию путем пипетирования вверх и вниз 10 раз и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще пять минут.

Должна присутствовать суспензия из небольших гроздей. Затем добавьте 20 миллилитров PBS и центрифугируйте в течение 10 минут 300 раз. G, осторожно аспирируйте PBS и при образовании индуцированных цино-предсердных телец или сабов используйте 12 миллилитров дифференцировочной среды, содержащей 400 микрограммов на миллилитр G 4 18 до Resus, суспензируйте клетки и поместите по два миллилитра каждый на шесть лунок 24-луночного желатинового покрытого пластины для получения одиночных узловых клеток, а не добавляйте дифференцировочную среду.

После удаления PBS используйте пять миллилитров Аккутана для подвешивания клеток и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Энергично проводите пипеткой вверх и вниз. Перемешайте суспензию после инкубации при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.

Добавьте 20 миллилитров PBS и центрифугируйте в течение пяти минут при 300-кратном G с дифференцировкой 12 миллилитров. Среда, содержащая G четыре 18. Подвесьте клетки и поместите по два миллилитра каждая на шесть лунок 24-луночной культуральной пластины, покрытой желатином, и проведите анализ клеток в соответствии с текстовым протоколом.

Используя протокол, продемонстрированный в этом видео, isab S может быть получен из плюрипотентных стволовых клеток с частотой биения около 450 ударов в минуту, как показано здесь после диссоциации isab S. Наблюдаемые одиночные клетки демонстрируют типичные формы клеток синусового узла, который включает веретенообразные и паутинные клетки. Эти клетки демонстрируют высокие уровни экспрессии белков, необходимых для функционирования синусового узла, таких как гиперполяризация, активированный циклическим нуклеотидным катионом. Канал четыре, HCN четыре, conexion четыре, пять conexion 30.2 и MYH шесть.

При лечении блокатором каналов ZD 7 2 88 или агонистом мускариновых рецепторов караколом, клетки, полученные от isab, демонстрируют значительно меньшую частоту биения. Агонист бета-рецепторов надпочечников изопрен, с другой стороны, приводит к повышенной частоте биения. В целом, наша методика проложит путь к лучшему пониманию функциональности кардиостимулятора и заболеваний.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить полнофункциональные синусовые узловые клетки из PLU-мощных стволовых клеток.