Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании клеточных взаимодействий между клетками рака легких и фибробластами, ассоциированными с раком, в трехмерном методе совместного культивирования. Это достигается за счет первичной культуры фибробластов, ассоциированных с раком легких человека, из собранной легочной ткани, которая измельчается на кусочки размером в один миллиметр. Второй шаг заключается в приготовлении коллагеновых гелей с фибробластами путем смешивания коллагенового раствора с использованием клеток трипсиновых глаз и переноса в шестилуночную пластину для желатинизации.

Затем клетки аденокарциномы легкого наносятся на поверхность каждого геля для получения объемной совместной культуры раковых клеток и фибробластов, и гель отделяется от края лунки для получения плавающей культуры. Заключительным этапом является проведение анализа культуры и инвазии воздушной жидкости путем воздействия воздуха на сжатые гели путем помещения их на сетку, расположенную в шестилуночной пластине. В конечном счете, гистологические исследования используются для оценки инвазии раковых клеток и морфологических изменений.

Основное преимущество этой процедуры перед существующими методами, такими как двумерная монослойная культура, заключается в том, что многоклеточные взаимодействия могут быть исследованы в трехмерной культуре состояния. Эта процедура начинается с первичного культивирования фибробластов из собранной легочной ткани, как описано и указано в текстовом протоколе. В этом видео вместо ткани рака легких человека используются легкие мыши.

Поместите образец легочной ткани на 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей без питательной среды. Разрежьте ткань на небольшие участки размером примерно один миллиметр с помощью стерильных щипцов и скальпеля Во время этого процесса избегайте пересыхания участка, в противном случае нарушается эффективность разрастания клеток. Размещайте небольшие участки легочной ткани друг от друга, чтобы вокруг каждого кусочка оставалась пустая область.

Сделайте царапины на поверхности чашки для культуры тканей с помощью лезвия скальпеля. В качестве альтернативы, покрытие кусочков ткани повышает эффективность роста клеток и размножения клеток после нескольких пассажей. Сначала поместите силиконовую смазку в две точки, на расстоянии 1,5 сантиметра друг от друга в каждую лунку.

Далее выложите кусочки фарша по отдельности в центр каждого. Ну а затем прикрепите крышку к поверхности пластины с помощью силиконовой смазки. Аккуратно добавьте питательную среду в чашку или в шестилуночную тарелку, пока срезы тканей не высохли.

Эффективный рост клеток по большей части теряется. Если образцы высыхают, не заливайте среду слишком быстро, чтобы избежать отслоения участков ткани для образования коллагенового геля. Промойте фибробласты одним х фосфатно-соевым буфером или PBS и добавьте триин один, чтобы отделить вырастающие клетки после трипсина в течение примерно пяти минут.

При 37 градусах Цельсия отделите клетки с помощью девяти миллилитров DMEM, дополненных 10% FBS, соберите взвешенные в среде клетки в 10-миллилитровую пробирку и центрифугируйте их при температуре от 200 до 300 раз G для образования клеточных гранул. Ресус. Полученные гранулы суспендировать в 100%FBS при плотности полмиллиона клеток на миллилитр. Перед приготовлением коллагенового геля охладите реактивы, пипетки и пробирки для приготовления коллагенового геля в холодильнике.

Затем приготовьте коллагеновый гель, смешав суспензию фибробластов в FBS Type One A collagen five X-D-M-E-M и энергично пипетируйте буфер для восстановления, чтобы обеспечить однородную смесь, предотвращая образование пузырьков в процессе пипетирования. Затем добавьте по три миллилитра смеси в каждую лунку шестилуночного планшета и дайте желатинизироваться в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия без нарушения в течение 30-60 минут для культивирования раковых клеток на коллагеновом геле Resus. Суспендируйте раковые клетки в 3D среде для совместного культивирования с плотностью от одного умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр.

Бедные два миллилитра ресуспендированного, А 5 49 раствора клеток аденокарциномы легкого на поверхность каждого геля. Модифицируйте количество клеток раковых клеток или фибробластов в кокультуре в зависимости от условий эксперимента для выполнения гелевого сокращения. Инкубируйте гели в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы раковые клетки могли прилипнуть к коллагеновому гелю.

Затем отделите каждый из них и создайте плавающую культуру в каждой лунке. Из шести лунок планшет с помощью наклонной иглы 21 калибра или небольшого шпателя отделять каждый гель от края лунки каждые два-три дня. Освежите лунки двумя миллилитрами 3D среды для совместной культуры.

Измеряйте размер каждого геля каждый день в течение пяти дней. Наконец, ознакомьтесь с текстовым протоколом для анализа коллагенового геля. После культивирования коллагеновые гели при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти дней.

Вынесите уплотненные гели на воздух, поместив их на сетку. В новых шестилуночных планшетах сетку изготавливают из имеющихся в продаже клеточных сетчатых фильтров, используемых для проточной цитометрии. Аккуратно заполните каждую лунку 11 миллилитрами 3D сокультуры. Терпимая.

Поместите гели на сетку с помощью стерильной ложки и удалите остатки среды из гелей при этом условии. Гели погружаются в среду, в то время как верхняя поверхность геля подвергается воздействию воздуха. Определите это условие культуры как границу раздела воздушно-жидкостных жидкостей.

Этот метод совместного культивирования, имитирующий микроокружение опухоли, является полезным инструментом для исследования взаимодействий между раковыми клетками и фибробластами, встроенными в коллагеновые гели. А 5 49 клеток совместно культивировали на коллагеновом геле, встроенном в фибробласты, и слой 5 49 клеток подвергали воздействию воздуха путем помещения геля на сетку в среде. Здесь показано репрезентативное изображение геля, помещенного на сетку в лунке шестилуночного планшета, гистологического анализа с гематом, тоином и эоином.

Окрашивание поперечных сечений трехмерно культивируемого геля выявило инвазию 549 клеток в коллагеновый гель, в который встроены фибробласты, ассоциированные с раком легких. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как экспрессия генов или нокдаун, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфическая функция гена во взаимодействии опухолевого шторма.