Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

Общая цель данной процедуры — исследовать клеточные взаимодействия между клетками рака легкого и ассоциированными с опухолью фибробластами с использованием метода трехмерного совместного культивирования. Это достигается путем создания первичной культуры ассоциированных с раком легкого фибробластов человека из собранной ткани легкого, измельченной на фрагменты размером один миллиметр. Следующим этапом является приготовление коллагеновых гелей с включенными в них фибробластами путем смешивания раствора коллагена с клетками, обработанными трипсином, и переноса смеси в шестилуночный планшет для гелеобразования.

Затем клетки аденокарциномы легкого высевают на поверхность каждого геля для создания трехмерной совместной культуры раковых клеток и фибробластов, после чего гель отделяют от края лунки для формирования плавающей культуры. Заключительным этапом является проведение культуры на границе раздела фаз «воздух-жидкость» и анализа инвазии путем экспозиции сократившихся гелей к воздуху, помещая их на сетку, расположенную в планшете на шесть лунок. В конечном итоге для оценки инвазии раковых клеток и морфологических изменений используют гистологическое исследование.

Основным преимуществом данной процедуры перед существующими методами, такими как двухмерное культивирование монослоя, является возможность исследовать многоклеточные взаимодействия в условиях трехмерного культивирования. Эта процедура начинается с первичного культивирования фибробластов из собранной ткани легких, как описано и указано в текстовом протоколе. В данном видео вместо ткани рака легкого человека используются легкие мыши.

Поместите образец легочной ткани в чашку для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров без питательной среды. С помощью стерильного пинцета и скальпеля разрежьте ткань на небольшие фрагменты размером примерно один миллиметр. В процессе выполнения данной процедуры не допускайте высыхания срезов, так как это снижает эффективность выживаемости и роста клеток. Расположите фрагменты легочной ткани на расстоянии друг от друга, чтобы вокруг каждого кусочка оставалось свободное пространство.

Сделайте царапины на поверхности чашки для культивирования тканей с помощью лезвия скальпеля. В качестве альтернативы, покрытие фрагментов ткани повышает эффективность разрастания и размножения клеток после нескольких пассажей. Сначала нанесите силиконовую смазку в две точки на расстоянии 1,5 centimeter друг от друга в каждой лунке.

Затем поместите измельченные кусочки ткани по отдельности в центр каждой лунки. После этого закрепите покровное стекло на поверхности планшета с помощью силиконовой смазки. Осторожно добавьте питательную среду в чашку или планшет на шесть лунок, не допуская высыхания срезов ткани.

Эффективный разрастание клеток в значительной степени утрачивается. Если образцы пересохли, не наливайте среду слишком быстро, чтобы избежать отрыва срезов ткани при формировании коллагенового геля. Промойте фибробласты одним объемом фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и добавьте трипсин для отсоединения разросшихся клеток, выдержав после трипсинизации примерно пять минут.

При температуре 37 °C отделите клетки, используя 9 мл DMEM с добавлением 10% FBS, соберите суспензию клеток в пробирке объемом 10 мл и центрифугируйте при 200–300 ×g до образования клеточного осадка. Ресуспендируйте полученный осадок в 100% FBS до достижения плотности 5 × 10⁵ клеток/мл. Перед приготовлением коллагенового геля предварительно охладите реагенты, пипетки и пробирки в холодильнике.

Затем подготовьте коллагеновый гель, энергично перемешав суспензию фибробластов в FBS, коллаген 1-го типа, 5X-DMEM и восстанавливающий буфер с помощью дозатора, чтобы обеспечить получение гомогенной смеси, избегая образования пузырьков воздуха в процессе дозирования. Затем добавьте по 3 мл смеси в каждую лунку 6-луночного планшета и оставьте для гелеобразования в инкубаторе при 37 °C в состоянии покоя на 30–60 минут. Для культивирования раковых клеток на коллагеновом геле ресуспендируйте раковые клетки в среде для 3D-сокультивирования до плотности 1 × 10⁵ клеток/мл.

Перенесите по 2 mL суспензии клеток аденокарциномы легкого A549 на поверхность каждого геля. В зависимости от условий эксперимента измените количество раковых клеток или фибробластов в совместной культуре для проведения контракции геля. Инкубируйте гели в течение ночи при 37 °C, чтобы раковые клетки могли прикрепиться к коллагеновому гелю.

Затем отделите каждый гель и создайте плавающую культуру в каждой лунке. Каждые два-три дня используйте иглу 21-го калибра под углом или небольшой шпатель, чтобы отделить каждый гель от края лунки шестилуночного планшета. Обновите среду в лунках, добавив 2 мл среды для 3D-сокультивирования.

Ежедневно измеряйте размер каждого геля в течение пяти дней. В завершение обратитесь к текстовому протоколу анализа коллагеновых гелей. После культивирования коллагеновых гелей при 37 °C в течение пяти дней.

Обеспечьте доступ воздуха к сжатым гелям, поместив их на сетку. В новых планшетах с шестью лунками сетку можно изготовить из имеющихся в продаже клеточных фильтров, используемых для проточной цитометрии. Аккуратно заполните каждую лунку 11 миллилитрами среды для 3D-сокультивирования (3D co-culture Medium).

Поместите гели на сетку с помощью стерильной ложки и удалите остатки среды с поверхности гелей при данных условиях. Гели погружены в среду, в то время как их верхняя поверхность контактирует с воздухом. Определите данное условие культивирования как интерфейс «воздух-жидкость».

Данный метод совместного культивирования, имитирующий микроокружение опухоли, представляет собой полезный инструмент для исследования взаимодействий между раковыми клетками и фибробластами, встроенными в коллагеновые гели. Клетки 5 49 культивировали совместно на коллагеновом геле с встроенными фибробластами, при этом слой клеток 5 49 подвергали воздействию воздуха, помещая гель на сетку в среде. Здесь представлено репрезентативное изображение геля, помещенного на сетку в лунке планшета на шесть лунок, с результатами гистологического анализа с окрашиванием гематоксилином и эозином.

Окрашивание поперечных срезов трехмерно культивируемого геля выявило инвазию клеток в коллагеновый гель с внедренными фибробластами, ассоциированными с раком легкого. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ экспрессии генов или нокдаун, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о функции конкретных генов во взаимодействии опухоли со стромой.