Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Целью данной процедуры является эффективное выделение и культивирование первичных нейронов из вентральной части среднего мозга грызунов. Это достигается путем предварительного препарирования среднего мозга эмбрионов грызунов. Вторым этапом является осторожное выделение вентральной части среднего мозга.

Затем нейронную ткань необходимо диссоциировать для получения суспензии одиночных клеток. Заключительным этапом является высев первичных нейронов в малом объеме на покровные стекла перед последующим переносом прикрепившихся клеток в 24-луночный планшет. В конечном итоге для идентификации дофаминергических нейронов в культуре используются антитела и иммунофлуоресцентная микроскопия.

Дофаминергические нейроны среднего мозга участвуют в нескольких функциях, включая контроль движений и эмоций в когнитивных процессах, а также в системе вознаграждения мозга. Они также задействованы в неврологических и нейропсихиатрических заболеваниях, включая болезнь Паркинсона, зависимость и шизофрению. Метод восстановления вентральной части среднего мозга.

Нейрональные культуры могут быть использованы для изучения физиологии и клеточных свойств дофаминергических нейронов, а также для понимания причин их дегенерации при таких расстройствах, как болезнь Паркинсона. Сначала подготовьте покровные стекла.

Прокипятите их в 70% ethanol в течение не менее 30 минут, чтобы удалить любые следы жира. Затем подвергните покровные стекла автоклавированию. Перенесите покровные стекла в 24-луночные планшеты и добавьте в каждую лунку по 0,5 mL polyol all athene.

Оставьте планшеты инкубироваться на один час при комнатной температуре. Обратите внимание, что срок годности рабочего раствора полиола или раствора Athene составляет один месяц. Затем промойте покровные стекла трижды, используя по 0,5 мл воды для каждой промывки.

Без всех трех этапов промывки культивируемые клетки не проживут и 24 часов. Далее приготовьте раствор ламинина. Обязательно предварительно разморозьте его медленно на льду.

Затем растворите ламинин в холодном D-M-E-M-F 12 и используйте его немедленно. Теперь добавьте по 0.5 mL свежеприготовленного рабочего раствора ламинина в каждую лунку и инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C. В завершение, при подготовке стеклянных пипеток, я шлифую их кончики до половины их обычного размера.

Сделайте разрез в брюшной полости, чтобы обнажить маточные рога, и с помощью пинцета аккуратно извлеките матку. Перенесите матку в чашку диаметром 100 мм с ледяным HBSS и приступайте к извлечению эмбрионов пинцетом. Перенесите изолированные эмбрионы в новую чашку с холодным HBSS.

Теперь под диссекционным микроскопом подготовьтесь к доступу к этой области вентрального среднего мозга при 10-кратном увеличении. С помощью бионожниц или пинцета проведите диссекцию мезэнцефалика и цефалической дуги, разрезав мозг в области перешейка и на границе мезэнцефалика и цефалической области. После извлечения всего среднего мозга сделайте разрез в медиальной дорсальной части среднего мозга.

С помощью пинцета удалите мозговые оболочки. Этот этап имеет решающее значение для успешного культивирования нейронов. Нейрональные клетки погибнут в условиях культивирования и будут оказывать негативное влияние на соседние нейроны.

Теперь распластайте ткань среднего мозга, придав ей форму «бабочки». Стерильным лезвием отсеките примерно половину каждого «крыла», оставив вентральную часть среднего мозга. Перенесите вентральную часть среднего мозга в охлажденный на льду раствор HBSS в коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем приступайте к препарированию следующего эмбриона, стараясь обработать как можно больше эмбрионов в течение одного часа. У эмбрионов, которые находились на льду более одного часа, наблюдается низкая жизнеспособность клеток. Чтобы обеспечить высокую жизнеспособность дофаминергических нейронов, время от момента препарирования до посева не должно превышать одного часа.

Кроме того, удаление мозговых оболочек имеет решающее значение для выживания нейронов в культуре. Удалите HBSS из пробирки с образцами вентрального среднего мозга. Затем добавьте 1 мл подогретого 0,05% раствора трипсина-ЭДТА; этого объема должно быть достаточно для 12 фрагментов ткани.

Инкубируйте ткань при 37 °C в течение 5–10 минут. В вытяжном шкафу замените трипсин A DTA одним миллилитром деактивирующей среды. Осторожно перемешайте содержимое путем встряхивания, затем удалите деактивирующую среду, оставив достаточное количество жидкости, чтобы избежать потери диссоциированных клеток.

Затем дважды промойте ткани полной средой, стараясь не потерять клетки. После этого добавьте 1 mL полной среды. Затем тритурируйте ткань с помощью огнеполированной пипетки, избегая образования пузырьков, до получения суспензии из одиночных клеток.

Должно быть достаточно примерно 8–10 пассажей. По истечении этого времени центрифугируйте клетки при 400 G в течение пяти минут. Удалите среду и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды.

Пропипетируйте клетки до четырех раз для получения суспензии. Начните с подсчета клеток в суспензии и оценки их жизнеспособности. Для этого используйте метод исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра.

Теперь доведите концентрацию суспензии клеток до 1500 клеток на µL. Затем перенесите стерилизованные крышки микроцентрифужных пробирок в чашки диаметром 100 мм. С помощью пинцета поместите подготовленные покровные стекла на крышки.

Не промывайте покровные стекла и старайтесь не допускать их высыхания. Нанесите по 100 µL суспензии на каждое покровное стекло. Этот несколько необычный метод обеспечивает 90% жизнеспособности культуры и является критически важным этапом для достижения успеха.

Затем закройте чашку Петри и поместите ее в инкубатор на один час. После инкабации осторожно перенесите покровные стекла с культуральной средой в 24-луночные планшеты, в каждую лунку которых добавлено 400 µL полной среды, подогретой до 37 °C, затем инкубируйте клетки в течение ночи. Первые несколько часов являются наиболее критическими для выживания клеток в течение 24 часов. Осторожно добавьте по 0,5 мл полной среды в каждую лунку.

Каждые две недели. Замените половину среды. Если культура желтеет, замену половины среды можно провести раньше, однако такие замены должны оставаться редкими.

Дофаминергические нейроны будут выживать в этих условиях более шести недель. После двух недель культивирования иммуногистохимический анализ на тирозингидроксилазу и нейрональные маркеры показывает, что 1% клеток являются дофаминергическими. Нейрональные отростки появляются в течение двух часов после посева.

К концу первого дня культивирования аксоны и дендриты становятся различимыми. В конечном итоге нейроны выживают более шести недель и демонстрируют интенсивный рост после применения данной процедуры. Для изучения механизмов функционирования дофаминергических нейронов могут быть использованы другие методы, такие как вирусная трансдукция, иммунофлуоресценция или электрофизиология.