Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Целью этой процедуры является эффективная изоляция и культивирование первичных нейронов из вентрального среднего мозга грызунов. Это достигается путем препарирования среднего мозга эмбрионов грызунов. Вторым шагом является тщательная изоляция вентрального среднего мозга.

Затем нейронная ткань должна быть диссоциирована, чтобы получить одноклеточную суспензию. Заключительным этапом является нанесение первичных нейронов в небольшом объеме на покровные листы перед поздним переносом прикрепленных клеток в 24-луночный планшет. В конечном счете, антитела и иммунофлуоресцентная микроскопия используются для идентификации дофаминергических нейронов в культуре.

Дофаминергические нейроны в среднем мозге участвуют в нескольких функциях, включая контроль движений и эмоций в когнитивных органах и секретор вознаграждения в мозге. Они также вовлечены в неврологические и психоневрологические заболевания, включая болезнь Паркинсона, зависимость и шизофрению. Метод восстановления вентрального среднего мозга.

Культуры нейронов могут быть использованы для изучения физиологии и клеточных свойств дофаминергических нейронов, а также для понимания причины их дегенерации. Во время течения таких расстройств, как болезнь Паркинсона. Для начала подготовьте покровные листы.

Прокипятите их в 70% этаноле не менее 30 минут, чтобы удалить любые следы жира. Затем автоклавируйте крышку прокладкой. Переложите крышки на 24 лунки и добавьте в каждую по полмиллилитра полиола всего атена.

Ну дайте пластинам понервироваться в течение часа при комнатной температуре. Обратите внимание, что срок годности рабочего полиола или раствора Афины составляет один месяц. Затем трижды постирайте чехол с половиной миллилитра воды на одну стирку.

Без всех трех промывок культивируемые клетки не продержались бы и 24 часа. Далее отремонтируйте раствор ламинина. Обязательно предварительно медленно разморозьте его на льду.

Затем растворите ламинин в холодном D-M-E-M-F 12, и используйте его сразу. Теперь по половине миллилитра свежеприготовленного рабочего раствора ламинина в каждую лунку и даем планшетам поинкубироваться в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, при подготовке стеклянной пипетки я полирую их кончики до половины их обычного размера.

Сделайте разрез брюшной полости, чтобы обнажить маточные мешочки и с помощью щипцов разрежьте матку. Перенесите матку в ледяной HBSS в 100-миллиметровую посуду и начните удаление эмбрионов с помощью щипцов. Перенесите выделенные эмбрионы в новую посуду с холодным HBSS.

Теперь под микроскопом вскрытия приготовьтесь получить доступ к этому участку вентрального среднего мозга при 10-кратном увеличении. Рассеките участки и головную дугу, разрезав головной мозг на перешейке и на границе участков и головных участков с помощью бионожниц или щипцов. После удаления всего среднего мозга сделайте разрез в медиальной дорсальной части среднего мозга.

С помощью щипцов удалите мозговые оболочки. Этот шаг имеет решающее значение для успеха нейронного культивирования. Ненейрональные клетки будут умирать под воздействием культуры и условий и негативно сигнализировать соседним нейронам.

Теперь расплющите ткань среднего мозга в форме бабочки. Отрежьте примерно половину каждого крыла стерильной лопастью, оставив брюшной средний мозг. Перенесите вентральный средний мозг в ледяной HBSS в конической трубке объемом 15 миллилитров.

Затем приступайте к препарированию следующего эмбриона, обрабатывайте как можно больше эмбрионов в течение часа. Эмбрионы, содержащиеся на льду более часа, имеют плохую жизнеспособность клеток. Для обеспечения высокой жизнеспособности дофаминергических нейронов время от рассечения до нанесения покрытия не должно превышать одного часа.

Кроме того, удаление мозговых оболочек имеет решающее значение для выживания нейронов под капюшоном. Удалите HBSS из коллекции вентрального среднего мозга. Затем добавьте миллилитр теплого 0,05%трипцина А ДТА, достаточно раствора на 12 кусочков ткани.

Инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-10 минут. Под капотом замените трипсин А ДТА на один миллилитр деактивации. Среду осторожно набухнуть, чтобы перемешать, а затем удалить дезактивирующую среду, но оставить достаточно среды, чтобы диссоциированные клетки не были отброшены.

Далее промойте ткани полным средством два раза, не теряя клеток. Теперь добавьте один миллилитр готового средства. Затем растирайте ткань с помощью отполированной огнем пипетки, не образуя пузырьков, до получения одноклеточной суспензии.

Примерно от восьми до 10 проходов должно быть достаточно. По истечении длительности центрифугируйте клетки по 400 G в течение пяти минут. Удалите среду и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре готовой среды.

Пипетируйте клетки до четырех раз, чтобы добиться получения суспензии. Начните с подсчета и оценки здоровья клеток в суспензии. Использование триамного синего исключения с помощью гемоцитометра.

Теперь отрегулируйте клеточную суспензию до 1500 клеток на микролитр. Затем перенесите стерилизованные крышки микроцентрифужных пробирок в 100-миллиметровую посуду. Наденьте подготовленную крышку на колпачки с помощью щипцов.

Не стирайте чехлы и старайтесь не допускать их пересыхания. Загрузите 100 микролитров суспензии на каждую крышку. Этот несколько необычный метод обеспечивает 90% жизнеспособность культуры и является важным шагом к успеху.

Затем закройте чашку Петри и перенесите ее в инкубатор на час после инкубации, осторожно перенесите покровные стекла со средой в 24 лунки, содержащие 400 микролитров полной среды теплой до 37 градусов Цельсия в каждую лунку, после чего инкубируйте ячейки на ночь. Первые несколько часов являются наиболее важными для выживания клеток в течение 24 часов. Аккуратно добавьте в каждую лунку по половине миллилитра готовой среды.

Каждые две недели. Смените половину носителей. Если культура пожелтела, то половинную смену среды можно провести раньше, но смена все равно должна быть нечастой.

Дофаминергические нейроны будут выживать в этих условиях более шести недель. После двух недель культивирования иммуногистохимия против тирозина, гидроксилазы и нейрональных маркеров показала, что 1% клеток являются дофаминергическими. Нейронные проекции появляются в течение двух часов после осаждения.

К концу первых суток в культуре различимы аксоны и дендриты. В конечном счете, нейроны выживают более шести недель и демонстрируют обширный рост после этой процедуры. Другие методы, такие как вирусная трансдукция, иммунная флуоресценция или электрофизиология, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на механистические вопросы в дофаминергических нейронах.