Отслеживание костного мозга мышей моноцитов В Vivo

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации трафика моноцитов в костном мозге черепа живой мыши с помощью двухфотонной визуализации. Сначала мышь обезболивают и вводят раствор гнили, рубина декстрана, чтобы пометить сосудистую сеть. Затем мышь помещается в специальную металлическую опору, а кожа головы от задней части теменной кости до лобной кости удаляется.

Затем резиновое кольцо прикладывается непосредственно к черепу с помощью хирургического клея, а резервуары заполняются жидким физиологическим раствором. Наконец, многофотонная микроскопия используется для отслеживания развития флуоресцентных клеток с течением времени в костном мозге черепа. Это может помочь ответить на ключевой вопрос в области иммуногематологии, такой как механизм мобилизации моноцитов в равновесном состоянии или после химиотерапии.

Таким образом, этот метод может дать представление о поведении модульных моноцитов. Он также может быть применен для изучения других субпопуляций клеток костного мозга в зависимости от специфичности используемого репортера о гриппе. В следующем протоколе используется многофотонный микроскоп в сочетании с лазером на кристалле титанового сапфира и операционным модулятором для управления мощностью лазера.

Для обеспечения одновременной записи трех флуоресцентных каналов конфигурация должна включать три внешних детектора сканирования или nds без DS с комбинацией дихроичных зеркал 565 нм и 690 нм, полосовых фильтров 565, 610 нм и 500 550 нм, а также фильтр коротких частот 485 нанометров. Обратите внимание, что в этой конфигурации генерация второй гармоники или SHG и голубой флуоресцентный белок или CFP обнаруживаются NDD после фильтра коротких частот 485. CFP также обнаруживается NDD.

После полосы пропускания 500 550 фильтр и стержневой домин декстран обнаруживается NDD. После фильтра полосы пропускания 565 610, за несколько часов до получения изображения, установите нагревательную камеру на 32 градуса Цельсия. Эта температура будет поддерживать оптимальную температуру тела мыши на протяжении всего эксперимента.

Обратите внимание, что используемая здесь нагревательная камера темная и закрывает объективы и моторизованную пластину системы. Это помогает избежать внешнего светового загрязнения. Чтобы сначала включить систему, включите титановый сапфировый лазер, а затем включите остальную часть микроскопа.

Запустите программное обеспечение для сбора данных. Здесь используется программное обеспечение Zeiss Zen. Установите диапазон длин волн лазера на 870 нанометров.

Затем выберите подходящий NDD для записи. Мышь, используемая в этом эксперименте, представляет собой трансгенную мышь под названием Mac blue, которая экспрессирует голубой флуоресцентный белок под контролем промотора одного рецептора спинномозговой жидкости. Рекомендуемый метод анестезии зависит от продолжительности визуализации, поэтому лучше всего обратиться к сопроводительному документу для получения подробной информации.

Сложным аспектом этой процедуры является инъекция в Т-вену, так как довольно легко пропустить вену. Если это произошло, вместо этого выполните ретроорбитальную инъекцию. После того, как мышь будет обезболена, используйте кусачки, чтобы проверить потерю сознания, стимулируя подушечку ноги. Следующий.

Для окрашивания сосудистой сети вводят 200 микролитров палочкового домин декстрана в хвостовую вену, или для окрашивания нейтрофилов. Введите 100 микролитров физиологического раствора, содержащего LY six GPE. После инъекции поместите головку мыши между удерживающими пластинами изготовленного на заказ стереотаксического держателя, адаптированного к микроскопу и к ингалятору с анестезирующим газом.

Это гарантирует, что дыхательные движения не повлияют на визуализацию. Затяните удерживающие пластины, чтобы натянуть кожу между ушами и головой. Проверьте стабильность.

При аккуратном надавливании на голову кусачками, голова не должна двигаться. Затем убедитесь, что животное дышит нормально. Чтобы подготовить мышь к двухфотонной визуализации, с помощью пальца нанесите 70% этанол на волосы на коже головы, стараясь избегать попадания в глаза.

Затем поместите драпировку с вырезом, чтобы обнажить кожу головы. Далее с помощью стерильных ножниц и кусачек разрежьте кожу головы и полностью удалите волосистую часть головы от задней части теменной кости до лобной кости. Соблюдайте дистанцию в три миллиметра от глаз и ушей, чтобы предотвратить обширное кровотечение.

Удалите рыхлую соединительную ткань или надкостницу, покрывающую череп. Затем с помощью теплого бумажного полотенца, смоченного PBS, промойте оставшиеся волосы, как показано здесь. С помощью иглы малого калибра нанесите хирургический клей на всю периферию резинового кольца диаметром 10 миллиметров.

Затем поместите резиновое кольцо прямо на череп с помощью другого смоченного в PBS бумажного полотенца. Очистите внутреннюю часть кольца в последний раз. Добавьте теплые ПБС, чтобы полностью погрузить череп.

Затем поместите стереотаксический держатель под объектив. Как только мышь будет на месте, используйте окуляр микроскопа с прямым пропусканием, чтобы рассмотреть череп и примерно расположить его в поле зрения микроскопа. В левом верхнем углу окна программного обеспечения для обработки изображений нажмите на «Сбор данных в реальном времени».

В центре окна появится сканирование ткани в реальном времени с помощью микроскопа, управляющего направлением в программном обеспечении. Найдите область с помощью CFP и сигнала доминирования стержня, чтобы скорректировать фокус. Затем установите мощность лазера на минимум, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал/шум с минимальным фотоповреждением.

Далее в программном обеспечении нажмите на вкладку канала и увеличьте мощность усиления на ФЭУ для каждого NDD, чтобы уменьшить обесцвечивание фотографий и повреждение фотографий, затем нажмите на соответствующую вкладку, чтобы установить настройки сбора данных на одиночное сканирование с временем задержки пикселей 1,58 микросекунды и разрешением 512 на 512 пикселей с увеличением 1,5. После того, как параметры записи установлены, нажмите на команду сбора данных в реальном времени и осмотрите ткань, чтобы выбрать желаемое поле x, y, z для мониторинга в режиме реального времени. Здесь выбирается поле, включающее как сосудистую, так и паренхиматозную области.

Затем сохраните или зарегистрируйте координаты X, Y, Z поля, показанного на вкладке позиций. Нажмите на кнопку «Добавить». Повторите этот процесс с тремя дополнительными полями, чтобы зарегистрировать все интересующие вас координаты.

Координаты появятся на вкладке «Позиции» рядом с инструкциями для программного обеспечения. Чтобы сделать захват стека изображений из трех DZ, нажмите «Переместить в» на вкладке «Позиции» в программе, чтобы перейти к первой зарегистрированной позиции, и выберите Zack в верхнем левом поле программы. Это откроет вкладку «Стек Z», переместится в самую высокую позицию Z и соответствующим образом отрегулирует мощность лазера.

Нажмите на последнюю установку, затем перейдите в самую глубокую позицию. Отрегулируйте мощность лазера. Затем сначала нажмите на набор.

Толщина стека анализа должна быть быстро адаптирована к исследуемой ячейке. Движущиеся ячейки быстро выйдут из строя, поэтому вам нужно будет обзавестись более толстым стеком. Затем вы приобретаете для медленно движущихся клеток.

В левом верхнем поле выберите команду временных рядов, чтобы открыть вкладку временных рядов. Установите количество циклов и временной интервал. Здесь один объем будет регистрироваться каждые 30 секунд в течение 60 циклов.

Это составляет 30 минут в реальном времени. Чтобы начать покадровую съемку в главном окне, выберите «Начать эксперимент» на протяжении всей процедуры, продолжайте наблюдать за животным, чтобы убедиться, что оно находится без сознания. Также убедитесь, что цель правильно погружена.

После того, как последовательность будет записана, используйте пипетку для добавления теплого PBS. Затем начните второй 30-минутный сбор данных. Если во время сбора данных наблюдается прогрессирующее исчезновение сигнала, проверьте наличие утечки PBS.

После того, как все необходимые видео были записаны, проведен анализ данных, как описано в сопроводительном документе, для изучения физиологии костного мозга с помощью внутрижизненной визуализации, трансгенной мыши Mac blue было введено 2 миллиона декстрана палочек Далтона, и получена визуализация с помощью двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии. Как показано на этом видео, на полученной микрофотографии сосудистая сеть, окрашенная 2 миллионами Дальтоновского палочки домин декстрана, показана красной костью, показанная синим, визуализирована с помощью генерации второй гармоники. ECFP-положительные моноциты, показанные в голубом цвете, расположены в паренхиматозных нишах, которые видны как темные участки между сосудистой и костной сетью, а также внутри сосудов.

Для расчета траектории отдельных клеток была проведена покадровая визуализация. В этом видео показано миграционное поведение паренхиматозных моноцитов. Сигнал ECFP имеет голубой цвет, а пути миграции для каждого красного пятна отображаются зеленым.

Здесь можно увидеть миграционное поведение сосудистых моноцитов. Эти данные могут быть использованы для вычисления как средней скорости, так и среднего квадратичного смещения ячеек. Обратите внимание, что сосудистые моноциты демонстрируют как повышенное смещение, так и повышенную скорость по сравнению с паренхиматозными моноцитами.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как отслеживать моноциты костного мозга мыши in vivo с помощью двух фотоизображений После его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению миграции клеток и взаимодействия в костном мозге, который представляет собой очень важный участок кроветворения, а также другие фундаментальные функции, такие как прайминг антигена и иммунологическая память.