Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Общая цель данной процедуры — изучить, как резидентные клетки ткани влияют на способность сосудистых эндотелиальных клеток поддерживать рекрутирование лейкоцитов при воспалении. Для этого сначала создаются кокультуры эндотелиальных клеток с мезенхимальными стволовыми клетками с использованием одной из двух моделей сосудов in vitro: микрослайд-модели или фильтр-модели. Затем эти культуры обрабатывают цитокином перед проведением анализа потока.

Затем потоковая система адгезии собирается поэтапно с внесением модификаций в зависимости от используемой модельной системы. Заключительным этапом является перфузия лейкоцитов через эндотелиальные клетки с последующим наблюдением за их привлечением из потока, а также за их дальнейшим поведением. В конечном итоге эти многоклеточные анализы адгезии на основе потока показали, что взаимодействие между мезенхимальными стволовыми клетками и эндотелиальными клетками подавляет привлечение нейтрофилов при воспалении.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области миграции лейкоцитов, например, каким образом резидентные клетки тканей, такие как мезенхимальные стволовые клетки, модифицируют этот процесс? Изменяется ли он при таких заболеваниях, как хроническое воспаление или рак? Можем ли мы использовать эти знания для разработки новых терапевтических стратегий? Для начала создайте кокультуры эндотелиальных клеток с мезенхимальными стволовыми клетками, используя модель с микрослайдом или модель с фильтром, как описано в текстовом протоколе по сборке системы потока.

Сначала включите нагреватель и установите температуру 37 °C. Затем подсоедините к трехходовому крану шприц объемом 20 мл без поршня, а также шприц объемом 5 мл. Далее отмерьте и отрежьте длинный отрезок трубки диаметром 2,4 мм, длина которого примерно равна расстоянию между клапаном и трехходовым краном.

Отрежьте кусочек трубки диаметром 1,3 мм длиной от 8 до 10 мм и вставьте его в один из концов толстой трубки. Присоедините сторону с толстой трубкой к трехходовому крану, а конец тонкой трубки — к порту электронного трехходового микроклапана для создания резервуара для промывки.

Затем прикрепите кран к камере из перспекса с помощью микропористой ленты. Далее отрежьте кусок толстой и тонкой трубки длиной от шести до восьми миллиметров и вставьте тонкую трубку в один из концов толстой трубки. Присоедините конец толстой трубки к шприцу объемом 2 мл, предварительно извлепив из него поршень.

Теперь подсоедините конец тонкой трубки шприца объемом 2 мл к порту электронного микроклапана, чтобы создать резервуар для образца. Затем отмерьте и отрежьте длинный отрезок тонкой трубки, равный расстоянию от микроклапана до центра предметного столика микроскопа. Для модели с микропрепаратом прикрепите отрезок толстой трубки длиной 8–10 мм к концу тонкой трубки.

Затем установите L-образный соединитель на конец толстой трубки. Он будет соединять систему с микропрепаратом или моделью фильтра. Прикрепите отрезок соединительной трубки манометра Portex blue line длиной от 8 до 10 мм к концу тонкой трубки.

Затем установите конец тонкой трубки на микроклапан. Эта трубка станет общим выходным каналом для резервуаров с промывочным раствором и образцом. Заполните резервуары фосфатно-солевым буфером с добавлением бычьего сывороточного альбумина.

Промойте трубки раствором PBSA, пропустив его через систему для удаления пузырьков воздуха, затем подсоедините трубку манометра к стеклянному шприцу объемом 50 milliliter. В случае использования модели микрослайда прикрепите к концу трубки манометра, ведущей к стеклянному шприцу, отрезок толстой трубки длиной 10–12 millimeter. На конец толстой трубки установите L-образный коннектор.

Подготовьте шприц, заполнив его 10 миллилитрами PBSA. Переверните шприц так, чтобы конец, соединенный с трубкой, был направлен вверх, и вытесните все пузырьки воздуха, после чего снова заполните его пятью миллилитрами PBSA. Наконец, поместите стеклянный шприц в шприцевой насос для проведения инфузии и забора жидкости.

Установите скорость наполнения и диаметр стеклянного шприца для подготовки микропрепаратов к потоку. Поместите микропрепарат на предметный столик инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Поверните трехходовой кран, чтобы обеспечить прохождение PBSA через входную трубку.

Подсоедините Г-образный коннектор к входному порту канала микрослайда. Затем вставьте Г-образный коннектор от шприцевого насоса в выходной порт канала. Удалите весь PBSA, который капнул на микрослайд.

В качестве альтернативы, для создания модели фильтра сначала вырежьте из парафильма фрагмент того же размера, что и стеклянная покровная пластинка, используя металлический шаблон. Затем с помощью металлического шаблона вырежьте в парафильме прорезь размером 20 на 4 мм для формирования проточного канала. Используйте прокладку из парафильма, чтобы наметить проточный канал на стеклянной покровной пластинке.

Совместите края фильтра с разметкой на предметном стекле. Убедитесь, что фильтр перекрывает метки проточного канала. Осторожно вырежьте фильтр, используя скальпель типа 10.

Затем осторожно накройте фильтр прокладкой из парафильма, убедившись, что прорезь проточного канала находится посередине фильтра. С помощью чистого бумажного салфетки вытесните все пузырьки воздуха. Теперь поместите покровное стекло в углубление нижней пластины проточной камеры из перспекса.

Поместите верхнюю перспекс-пластину поверх прокладки и закрутите пластины между собой. Поверните трехходовой кран, чтобы обеспечить прохождение промывочного буфера PBSA через клапан. Затем подсоедините трубку манометра к входному порту верхней перспекс-пластины.

Пропустите PBSA через проточный канал, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем подсоедините трубку манометра от шприцевого насоса к выходному порту перспекс-пластины. Удалите весь PBSA, который попал на верхнюю пластину камеры.

Наконец, установите камеру на предметный столик инвертированного фазово-контрастного микроскопа и отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать эндотелиальные клетки над фильтрами для последующей перфузии лейкоцитов поверх эндотелиальных клеток. Установите шприцевой насос в режим заполнения и нажмите кнопку запуска после настройки фокуса. Чтобы визуализировать монослой эндотелиальных клеток, внесите два миллилитра очищенных нейтрофилов в резервуар для образца и оставьте для прогрева на две минуты.

Затем промойте эндотелий раствором PBSA в течение двух минут. Откройте клапан для перфузии нейтрофилов над эндотелием. Подавайте болюс нейтрофилов в течение четырех минут.

Закройте клапан и в течение оставшегося времени эксперимента проводите перфузию PBSA из резервуара для промывки. При проведении эксперимента следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не проходили через систему на любом этапе анализа, так как это приведет к нарушению монослоя эндотелиальных клеток и откреплению адгезированных нейтрофилов. Регистрируйте рекрутирование нейтрофилов либо во время их потока, либо после перфузии, используя программное обеспечение для захвата цифровых изображений.

Определите центр канала, переместив объектив к краю канала у входного порта и найдя середину порта. Выполните все цифровые записи как минимум в пяти-десяти полях в центре проточного канала или during neutrophil flow. Снимайте изображения одного поля каждые 10 секунд в течение одной минуты, затем переместитесь вдоль канала и записывайте другое поле в течение одной минуты.

Повторяйте этот процесс в течение всего времени введения болюса для записи после перфузии. Выполните десятисекундную запись в пяти-десяти полях вдоль центра канала потока для оценки поведения лейкоцитов. Делайте снимки каждую секунду в течение этого десятисекундного интервала.

Это обеспечивает достаточное время для захвата из потока и анализа поведения адгезивных нейтрофилов. Запишите одно поле, содержащее не менее 10 трансмигрировавших нейтрофилов, в течение пяти минут, делая снимки каждые 30 секунд. Для расчета скорости мигрировавших клеток можно записать еще одну серию полей по десять секунд.

Это дает нейтрофилам время для миграции через эндотелиальный монослой. Наконец, остановите шприцевой насос, отсоедините выходную трубку, затем входную трубку, разберите проточную камеру и промойте резервуар для образца раствором PBSA; повторите процедуру для последующих фильтров и каналов микрослайда перед тем, как приступить к анализу рекрутирования и поведения лейкоцитов, как описано в текстовом протоколе. В модели на микрослайде стимуляция цитокинами с использованием фактора некроза опухоли альфа значительно увеличивала адгезию нейтрофилов к эндотелию дозозависимым образом.

Кроме того, наблюдалось дозозависимое снижение процента нейтрофилов, катящихся по поверхности эндотелия, под воздействием TNF alpha. Это отразилось в дозозависимом увеличении процента нейтрофилов, мигрирующих через эндотелиальный монослой и, таким образом, осуществляющих трансэндотелиальную миграцию. Аналогичные результаты были получены при использовании метода анализа потока на фильтре.

Например, стимуляция TNF alpha увеличивала адгезию нейтрофилов дозозависимым образом. Сокультивирование эндотелиальных клеток с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга значительно снижало адгезию нейтрофилов по сравнению с эндотелиальными клетками. Клетки, культивируемые отдельно, вели себя ожидаемо для модели на микрослайде.

Снова наблюдались аналогичные эффекты при использовании модели на основе фильтра: адгезия в сокультуре была ниже, чем в монокультуре. После просмотра этого видео вы должны иметь четкое представление о том, как изучать взаимодействие стромальных и эндотелиальных клеток, влияющее на привлечение лейкоцитов при воспалении.