Создание человека эпителиальных Enteroids и Colonoids из цельной ткани и биопсия
6 марта 2015 г.
Мы описываем метод определения человеческих энтероидов из крипт тонкого кишечника и колоноидов из крипт толстой кишки, собранных как из хирургических тканей, так и из биопсий. В данной методологической статье мы представляем методы культивирования, которые необходимы для успешного роста и поддержания энтероидов и колоноидов человека.
Общая цель данной процедуры заключается в получении энтероцитов человека из тканей кишечника. Это достигается путем первоначального отделения слизистой оболочки кишечника от подлежащей подслизистой ткани. На втором этапе слизистую оболочку инкубируют с EDTA для стимуляции диссоциации эпителия от соединительной ткани.
Затем кишечные крипты отделяют от диссоциированного эпителия. В завершение кишечные крипты культивируют в матриксе базальной мембраны. В конечном итоге для демонстрации организации эпителия, а также специфических эпителиальных маркеров культивируемых OID используют методы иммуногистохимии.
Значимость данного метода заключается в том, что теперь мы можем генерировать ОИД из биопсий конкретных пациентов, а значит, можем использовать эти ткани в лаборатории для изучения кишечных заболеваний и проведения диагностики, что ранее было невозможно. После приготовления буферов и реагентов согласно текстовому протоколу, разморозьте базальную мембрану на льду и, после получения ткани, поместите 24-луночный планшет для преинкубации в инкубатор с углекислым газом при 37 °C. Используйте PBS без кальция и магния (KO) или DPBS для промывки ткани до тех пор, пока раствор DPBS не станет прозрачным.
Поместите ткань слизистой стороной вверх в стеклянную чашку Петри с силиконовым покрытием, заполненную ледяным DPBS, и зафиксируйте ее, растянув и закрепив иглами Минухина. Затем под диссекционным микроскопом с помощью микродиссекционных ножниц и изогнутого пинцета с тонкими кончиками отделите слизистую оболочку от подслизистого слоя и соединительной ткани. После этого, расположив слизистую стороной вверх, растяните и закрепите отделенную слизистую оболочку плоско на стеклянной чашке Петри с силиконовым покрытием.
С помощью изогнутого пинцета аккуратно соскоблите поверхность слизистой оболочки. Этот этап необходим для повышения качества препарата. Покройте слизистую оболочку свежеприготовленным 2 mM хелатирующим буфером EDTA.
Затем, после промывки ткани на льду три-четыре раза в соответствии с текстовым протоколом под диссекционным микроскопом, с помощью изогнутого пинцета аккуратно соскребите слизистую оболочку, чтобы высвободить кишечные крипты в пипетку. Осторожно удалите суспензию крипт из чашки Петри и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем проверьте ткань, чтобы убедиться, что почти все крипты были удалены из слизистой оболочки.
Профильтруйте суспензию крипт через фильтр 150 мкм дважды и с помощью микроскопа проверьте проходимость. После промывки суспензии крипт и переноса необходимого количества крипт в круглодонную пробирку объемом 5 мл, согласно текстовому протоколу, центрифугируйте фракцию крипт в течение 10 минут при 150 G и 4 °C. Затем удалите супернатант с помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток и ресуспендируйте осадок крипт в матриксе базальной мембраны.
В каждую лунку предварительно прогретого планшета внесите по 50 µL суспензии криптоидов в матриксе базальной мембраны, медленно выдавливая матрикс базальной мембраны в центр лунки. Инкубируйте планшет в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 минут для полной полимеризации матрикса базальной мембраны. Затем нанесите поверх матрикса базальной мембраны 500 µL полной среды для человеческого мини-кишечника, дополненной CHIR 9 0 2 2 1 в концентрации 2.5 µM.
И Тхиен инкубируют ткань, меняя среду через два дня, а затем через день. На этом рисунке представлен типичный пример свежевыделенных крипт из целой ткани. Количество крипт, выделенных из биоптата, меньше, чем из целой ткани.
Обычно за один проход делают два биопсийных забора. Каждый забор дает поверхность площадью 10 квадратных миллиметров, содержащую в среднем от 50 до 100 крипт на биопсию. После культивирования в матриксе базальной мембраны в течение пяти-шести дней крипты округляются, образуя энтеросферы для тонкого кишечника и колоносферы для толстого кишечника, которые подвергаются пассированию через семь дней.
Органоиды или ОИД, полученные из биоптатов, показанные здесь, проходят тот же процесс развития при более низкой плотности посева. Поэтому упаковка обычно проводится через 10–12 дней культивирования. Как показано здесь, как OIDs, так и OIDs имеют просветную сторону и выстланы эпителием.
Внутри OID можно наблюдать пролиферирующие клетки, которые располагаются в верхушках почек. Конфокальная визуализация OID, окрашенных е-катрином (зеленый цвет), демонстрирует эпителиальные клетки. На данном рисунке представлены энтероиды, выращенные из клеток пациента с муковисцидозом и пучковой энтеропатией, вызванной врожденной мутацией в гене молекулы адгезии эпителиальных клеток.
После данной процедуры можно использовать такие методы, как ПЦР в реальном времени или вестерн-блоттинг, для получения дополнительных ответов на вопросы относительно интересующего гена или белка. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как стабильно изолировать человеческие CRISPR, чтобы иметь возможность эффективно создавать их в вашей лаборатории для решения конкретных вопросов, касающихся ваших пациентов.
Обзор
В данной статье описывается метод получения энтероидов человека из крипт тонкого кишечника и колоноидов из крипт толстой кишки. В протоколе изложены основные условия культивирования, необходимые для успешного роста и поддержания данных органоидов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Гастроэнтерология
Теоретические основы
- Энтероиды и колоноиды человека получают из тканей кишечника.
- Данный метод позволяет проводить персонализированные исследования заболеваний кишечника.
- Предыдущие методы не позволяли эффективно использовать биоптаты пациентов.
- Для анализа организации эпителия применяется иммуногистохимия.
Цель исследования
- Получение органоидов человека из тканей кишечника.
- Содействие исследованиям заболеваний кишечника и диагностике.
- Углубление понимания поведения эпителиальных клеток в культуре.
Используемые методы
- Отделение слизистой оболочки кишечника от подслизистой ткани.
- Инкубация с EDTA для диссоциации эпителия.
- Культивирование крипт кишечника в матриксе базальной мембраны.
- Использование конфокальной микроскопии и иммуногистохимического анализа для исследования.
Основные результаты
- Успешное выделение кишечных крипт из биоптатов.
- Создание органоидов, имитирующих структуру кишечника.
- Наблюдение за пролиферирующими клетками внутри органоидов.
- Демонстрация развития специфичных для пациента органоидов.
Выводы
- Данный метод позволяет эффективно генерировать энтероиды человека.
- Он открывает возможности для изучения специфических кишечных заболеваний конкретных пациентов.
- Перспективные области применения включают анализ экспрессии генов и моделирование заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Модели человеческих энтероидов и колоноидов представляют собой физиологически релевантную систему для изучения биологии кишечного эпителия и механизмов заболеваний. Данный подход позволяет создавать индивидуальные модели заболеваний, что способствует валидации мишеней и снижению предварительных рисков в программах по разработке лекарственных препаратов для гастроэнтерологии. Этот метод связывает фундаментальную биологию с трансляционными исследованиями посредством создания масштабируемых и воспроизводимых моделей тканей человека.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием полученных от пациентов эпителиальных клеток кишечника, сохраняющих естественное клеточное разнообразие и полярность.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем моделирования соответствующих заболеванию эпителиальных фенотипов из биопсийного материала.
- Трансляционная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет сохранения специфического для пациента генетического фона в масштабируемой системе 3D-культивирования.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные эпителиальные монослои и сфероиды, подходящие для высококонтентного имиджинга и рабочих процессов скрининга соединений.
- Количественные результаты: обеспечивает измерение организации, пролиферации и дифференцировки эпителия с помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии.
- Воспроизводимость: устанавливает единообразные условия изоляции и культивирования крипт, что имеет решающее значение для стандартизации анализа между различными лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирование заболеваний: Облегчает изучение специфических для пациента состояний кишечника, таких как муковисцидоз и туфтинг-энтеропатия, с использованием органоидов, полученных из биоптатов.
- Доклиническая преемственность: Поддерживает переход от этапа открытия к доклинической валидации за счет сохранения структуры эпителия и активности стволовых клеток с течением времени.
- Согласование биомаркеров: Позволяет коррелировать фенотипы органоидов с клиническими биомаркерами для принятия решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в цикл поиска новых лекарственных средств, предоставляя модели эпителия человека для исследований взаимодействия с мишенью, анализов модуляции сигнальных путей и скрининга токсичности перед этапом оптимизации соединений-лидеров.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством контролируемого манипулирования кишечным эпителием, полученным от пациентов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные для скрининга соединений за счет стандартизированного посева крипт и встраивания в матрикс.
- Аналитика: предоставляет данные на основе визуализации (например, полярность эпителия, маркеры пролиферации), что позволяет проводить сравнительный анализ при различных генетических условиях или вариантах лечения.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклинической работой за счет сохранения специфических для пациента мутаций и фенотипов эпителия, имеющих значение при желудочно-кишечных заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: создает возобновляемую платформу для использования в нескольких проектах при валидации мишеней, изучении механизмов действия и профилировании безопасности.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней с помощью физиологически релевантных моделей эпителия человека.
- Операционная ценность: Стандартизированные протоколы диссоциации и культивирования обеспечивают воспроизводимость результатов в разных центрах и разными операторами.
- Стратегическая ценность: Обоснование решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения биологической неопределенности на ранних этапах доклинической оценки.
- Влияние на портфель: Возможность приоритизации соединений с учетом рисков на основе данных об эффективности и токсичности в кишечных системах человеческого происхождения.
Особенности реализации
- Для успешного получения органоидов требуются навыки препарирования тканей, изоляции крипт и методы 3D-культивирования.
- Для стабильного формирования органоидов необходимо наличие матрикса базальной мембраны, определенного состава питательных сред и инкубаторов с контролируемым уровнем CO2.
- Стандартизация обработки биоптатов и количественной оценки крипт необходима для кросс-функционального сотрудничества и сопоставимости данных.
- Адаптация к различным отделам кишечника (например, подвздошной кишке по сравнению с ободочной кишкой) требует оптимизации условий диссоциации и культивирования.
- Длительное поддержание культур требует регулярного пассирования и замены среды для предотвращения потери дифференцировки и чрезмерного разрастания.
