Генерация жировой стволовых клеток через дедифференцировка зрелые адипоциты в потолочных культур
7 марта 2015 г.
Зрелые адипоциты могут представлять собой обильный источник стволовых клеток за счет дедифференцировки, что приводит к однородной популяции фибробластоподобных клеток. Расщепление коллагеназы используется для выделения зрелых адипоцитов из жира человека. Целью нашего протокола является получение мультипотентных, дедифференцированных жировых клеток из зрелых адипоцитов человека.
Зрелые адипоциты способны дифференцироваться в клетки-предшественники in vitro. Это достигается с помощью метода культуры в герметичной среде (seal culture) — техники, при которой зрелые клетки культивируют в колбе, полностью заполненной средой, в перевернутом состоянии. Плавающие клетки прикрепляются к стенкам колбы и меняют свою морфологию, превращаясь из округлых клеток, заполненных липидами, в вытянутые фибробластоподобные клетки.Гомогенный.
Популяции вытянутых клеток можно получить и культивировать после доставки образцов ткани в лабораторию. Взвесьте жировую ткань и, в зависимости от необходимого количества адипоцитов, поместите соответствующий объем образца в пробирку объемом 50 мл для переваривания; ожидаемый выход составляет примерно 1 миллион клеток на грамм ткани.
Посев клеток на поверхность (ceiling cultures) проводят из расчета 500 000 клеток на колбу объемом 25 см и 50 000 клеток на каждую лунку шестилуночного планшета. Добавьте рабочий буфер KRH с коллагеназой, измельчите ткань ножницами и инкубируйте препарат при 37 °C в течение 45 минут. Во время инкубации подготовьте систему из трубок и шприца. Пропустите полупрозрачный раствор через нейлоновую сетку в пластиковый стакан с помощью пинцета.
Осторожно протрите клеточную суспензию через сетку и промойте 5 ml рабочего буфера KRH. С помощью шприца перенесите отфильтрованную клеточную суспензию в пробирку объемом 50 ml. Оставьте зрелые адипоциты постоять в течение приблизительно 10 минут.
Клетки всплывут на поверхность буфера. Медленно аспирируйте буфер снизу. С помощью шприца и трубки добавьте 20 mls рабочего буфера KRH для промывки.
Повторите этапы промывки дважды. Соберите буфер, чтобы довести суспензию адипоцитов до конечного объема 5 ml, и приступайте к подсчету клеток с помощью гемоцитометра; заполните флакон T 25 на три четверти его объема средой D-M-E-M-F 12 с добавлением 20% calf Serum, затем перенесите 500, 000 зрелых адипоцитов во флакон. Долейте среду во флакон до полного объема и удалите пузырьки воздуха с поверхности.
Закрутите на колбе импровизированную крышку. Инкубируйте колбу в перевернутом состоянии в течение одной недели в инкубаторе для культур клеток с 5% carbon dioxide. Избегайте перемещения колбы, так как оставшиеся пузырьки воздуха могут нарушить адгезию клеток.
Поместите покровное стекло на дно лунок. Вставьте в лунку пластиковую втулку и заполните лунку 8 мл среды. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.
Поместите покровное стекло на втулку, оставив зазор для введения наконечника пипетки. Отберите пробу из 50 000 клеток и введите их, поместив наконечник между покровным стеклом и втулкой. Инкубируйте планшет в инкубаторе для культур клеток с 5% carbon dioxide в течение недели или менее.
В зависимости от дизайна эксперимента, клеткам требуется не менее трех дней для адгезии к покровному стеклу в отдельном планшете. Переверните покровные стекла в 2 мл среды. В дальнейшем покровные стекла можно фиксировать в формалине для проведения экспериментов по иммунофлуоресценции или для экстракции ДНК, РНК и белков.
Дедифференцировка зрелых адипоцитов вызывает значительные изменения в морфологии клеток. В ходе этого процесса адипоциты теряют свой фенотип, и снижается экспрессия транскриптов, обычно связанных с их функцией накопления липидов. На данном изображении, полученном методом иммунофлуоресценции, представлены жировые клетки на разных стадиях дедифференцировки.
Клетки с округлой морфологией по-прежнему экспрессируют FABP four, маркер зрелого адипоцита, тогда как удлиненные клетки, согласно литературным данным, больше его не экспрессируют. D-дифференцированные жировые клетки, часто называемые D-жировыми клетками, могут быть получены от молодых, пожилых, худощавых пациентов или пациентов с OB base. Им присуща способность к длительному культивированию и доказанная мультипотентность.
Мне также нравится их потенциал для тканевой инженерии и клеточной терапии. Они могут стать новой моделью для специфического исследования физиологии адипоцитов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается процесс дедифференцировки зрелых адипоцитов в мультипотентные стволовые клетки. Используя метод переваривания коллагеназой и технику культуры в герметичных условиях, исследователи могут изолировать и культивировать эти клетки для получения гомогенной популяции фибробластоподобных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследования стволовых клеток
- Биология адипоцитов
- Методы культивирования клеток
Теоретическое введение
- Зрелые адипоциты способны к дедифференцировке в клетки-предшественники.
- Этот процесс может быть осуществлен in vitro с использованием специальных методов культивирования.
- Изоляция адипоцитов имеет решающее значение для получения стволовых клеток.
- Переваривание коллагеназой является стандартным методом изоляции клеток.
Цель исследования
- Получить мультипотентные дедифференцированные жировые клетки из зрелых адипоцитов человека.
- Разработать протокол выделения и культивирования этих клеток.
- Изучить морфологические изменения в процессе дедифференцировки.
Используемые методы
- Переваривание коллагеназой для выделения зрелых адипоцитов.
- Метод культивирования в герметичной среде для стимуляции дедифференцировки.
- Оценка морфологии клеток для подтверждения дедифференцировки.
- Количественное определение выхода клеток на основе массы ткани.
Основные результаты
- Успешное выделение примерно 1 миллиона клеток на грамм жировой ткани.
- Дедифференцированные клетки имели вытянутую фибробластоподобную морфологию.
- Описанные методы позволили получить гомогенные популяции клеток.
- Продемонстрирован потенциал зрелых адипоцитов как источника стволовых клеток.
Выводы
- Зрелые адипоциты могут быть эффективно преобразованы в мультипотентные стволовые клетки.
- Описанные методы представляют собой надежный подход для исследований в области стволовых клеток.
- Данное исследование вносит вклад в понимание пластичности адипоцитов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Дедифференцировка зрелых адипоцитов в мультипотентные стволовые клетки открывает новый источник для применения в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Данный подход позволяет проводить характеристику функций и метаболических свойств адипоцитов с учетом специфики конкретного жирового депо, что способствует валидации мишеней в исследованиях метаболических заболеваний. Этот метод предоставляет масштабируемую платформу для получения фибробластоподобных клеток с доказанной мультипотентностью, упрощая разработку доклинических моделей и снижение рисков при изучении механизмов в рамках поиска терапевтических средств, направленных на адипоциты.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пластичность адипоцитов и проверять терапевтические гипотезы в путях развития метаболических заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую систему функциональной валидации мишеней посредством выделения адипоцитов из конкретных жировых депо.
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет создания гомогенных популяций дедифференцированных клеток для выяснения механизмов сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа с помощью стандартизированного переваривания коллагеназой и метода культивирования под потолком (ceiling culture).
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемого выхода адипоцитов (приблизительно 1 миллион клеток на грамм ткани).
- Научная ценность: Возможность надежной оценки соединений с использованием фибробластоподобных клеток с подтвержденным снижением экспрессии FABP4 в качестве маркера дедифференцировки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Способствует разработке релевантных для заболеваний систем для специфического исследования физиологии адипоцитов.
- Практическая ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря способности к длительному культивированию дедифференцированных жировых клеток.
- Научная ценность: Облегчает принятие обоснованных решений по дальнейшему развитию с учетом рисков, демонстрируя мультипотентность и потенциал D-fat клеток для тканевой инженерии.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в процесс поиска и разработки — от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических исследований, в частности, в рамках программ по изучению метаболических заболеваний и регенеративной медицины.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и снижению биологических рисков путем моделирования дедифференцировки адипоцитов in vitro.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных благодаря стандартизированной изоляции клеток и оценке их морфологии.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели, такие как изменения экспрессии FABP4, для сравнения состояний дедифференцировки при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет подтвержденного длительного культивирования и мультипотентности дедифференцированных адипоцитов.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования метода получения стволовых клеток из адипоцитов в рамках нескольких исследований, специфичных для конкретных депо.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет снижения механистической неопределенности при переключении фенотипа адипоцитов.
- Операционная ценность: Стандартизация и масштабируемость благодаря определенным протоколам переваривания коллагеназой и инвертированного культивирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности характеризации метаболических свойств конкретных жировых депо перед оптимизацией ведущих соединений.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков посредством валидированной оценки выхода стволовых клеток и их дифференцировочного потенциала.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных адипоцитов и методах коллагеназного переваривания.
- Необходима инфраструктура для культивирования клеток, позволяющая поддерживать культуру в перевернутых колбах или 6-луночных планшетах (прикрепление клеток к «потолку» сосуда).
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения стабильного выхода адипоцитов и согласованности оценки дедифференцировки в разных лабораториях.
- При применении протокола к жировой ткани из разных депо или образцов от разных доноров следует учитывать необходимость адаптации метода.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость точного заполнения среды для предотвращения образования пузырьков, которые могут нарушить структуру культуры при инвертированном культивировании.
