Условный Генетическая Transsynaptic Трассировка в мозге эмбриональных мыши
22 декабря 2014 г.
Используя бинарную генетическую стратегию, мы предоставляем подробный протокол для трассировки нейронных цепей у мышей, которые экспрессируют комплементарные транссинаптические индикаторы после Cre-опосредованной рекомбинации. Поскольку продукция специфических для клеток индикаторов генетически закодирована, наш экспериментальный подход подходит для изучения формирования и созревания нейронных схем во время развития эмбрионального мозга мышей с разрешением одной клетки.
Цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать развитие нейронных цепей в мозге эмбриональной мыши с использованием трех различных систем маркировки клеток с использованием транссинаптического индикатора, который движется в обоих направлениях, второго индикатора, который движется только в обратном направлении, и третьей метки, которая не распространяется от клетки-мишени. Можно идентифицировать нейрон-мишень на восходящих и нисходящих нейронах. Результаты показывают, что этот экспериментальный протокол может быть использован для анализа формирования нейронных цепей в эмбриональном мозге самки мыши с разрешением одной клетки.
Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области нейробиологии развития, например, когда формируются конкретные нейронные цепи и как они организуются во время эмбрионального развития. Этот метод также может быть использован для отслеживания нейронных цепей у взрослых мышей. В частности, он может быть использован для анализа синаптической активности между генетически идентифицированными нейронами, а также может быть использован для анализа того, как различные экспериментальные условия могут модулировать нейронную цепь с течением времени.
Начнем с только что усыпленной беременной мыши. Очистите брюшную часть живота с помощью 70% этанола, а затем сделайте вертикальный разрез, чтобы обнажить эмбрионы. Удалите цепочку эмбрионов и перенесите их в чашку с ледяным PBS в чашку.
Удалите отдельные эмбрионы с помощью притупленных щипцов. Разделите отдельные эмбрионы в растворе с помощью тонких ножниц и щипцов, удаляя лишнюю ткань в процессе, когда эмбрионы будут полностью очищены. Возьмите небольшую биопсию хвоста у каждого эмбриона и поместите в пробирку с буфером для лизиса для сбора ДНК для идентификации пола и генотипирования.
Затем перенесите эмбрион в свежеприготовленный ледяной холод, 4%PFA на лед. После обработки каждого эмбриона дайте им инкубироваться в ПФА с перемешиванием не менее 1,5 часов, в зависимости от их размера. Когда инкубация завершена.
Простирайте неподвижные салфетки три раза ледяным PBS не менее пяти минут за одну стирку. Затем перенесите эмбрионы в 30% раствор сахарозы, поддерживаемый при температуре четыре градуса Цельсия. Когда ткани полностью погрузятся в раствор, приступают к криосекции.
Во-первых, начните с маркировки криоформы с помощью перманентного спиртостойкого маркера. Далее приготовьте кашицу из толченого сухого льда в 100% этаноле в ведре со льдом, используя кашицу, охладите стеклянный стакан изоп пентан в течение примерно 10 минут. Во время ожидания извлеките ткани из раствора сахарозы и сотрите излишки сахарозы стандартной лабораторной салфеткой.
Затем переложите ткань в предварительно помеченную криоформу. С достаточным количеством ОКТ, чтобы покрыть ткани. Не образуйте пузырьков воздуха в ОКТ, особенно вокруг тканей.
Затем сориентируйте ткань с помощью энтомологических щипцов, чтобы нанести минимальный ущерб. При необходимости заморозьте криоформы в охлажденной ванне изопентана без образования брызг. Замороженные формы можно упаковывать и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы разделить формы.
Нарежьте их на серийные секции толщиной 14 микрон последовательностью по пять. Соберите каждую серию из пяти срезов на супер морозном и стеклянном предметном стекле. При приготовлении раствора по этому протоколу обязательно медленно добавляйте твин 20 в тротиловый буфер, который должен быть приготовлен в свежем виде.
Затем медленно промойте раствор вверх и вниз, чтобы перемешать. При приготовлении буфера TNB добавляйте блокирующий реагент медленно с небольшим шагом при перемешивании. Затем нагрейте раствор до 55 градусов Цельсия с помощью водяной бани.
Раствор станет молочным. Теперь, чтобы начать работу с тканями, сначала используйте скальпель для удаления избытка ОКТ, окружающего участки ткани. Затем отметьте границы каждого участка с помощью ручки.
Дайте горкам дойти до комнатной температуры. Затем постирайте их при комнатной температуре одним буфером XPBS, три раза каждая стирка должна длиться пять минут. Затем погасите активность эндогенной пероксидазы, инкубируя предметные стекла в течение получаса в ледяном охладителе с 0,3% перекисью водорода в метаноле.
Затем сделайте три стирки в PBS при комнатной температуре в течение пяти минут за одну стирку. Затем инкубируйте предметные стекла в течение 10 минут в PBST, чтобы они проникли в ткани. На этот раз вымойте горки трижды с тротилом.
Теперь во влажной камере заблокируйте ткань в количестве, достаточном для покрытия каждого предметного стекла. Дайте блоку поработать полчаса при комнатной температуре. Не допускайте пересыхания горок.
После слива блокирующего буфера полностью накройте предметное стекло первичным антителом в TNB, чтобы связать индикатор. Выдерживать в течение двух часов при RT или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Чтобы удалить первичное антитело, промойте предметное стекло тротилом три раза при комнатной температуре в течение пяти минут за одну промывку.
Во время этих стирок используйте небольшое легкое помешивание. Далее инкубируйте срезы в растворе вторичного антитела в течение часа. При комнатной температуре позже используйте три промывки тротилом для удаления несвязанного вторичного антитела.
Затем во увлажненной камере инкубируйте ткани от одного до 100 очищенных от хавеина конъюгированных пероксидаз хрена в TNB в течение 30 минут при комнатной температуре, одновременно промывая предметные стекла в тротиле. После инкубации сделайте свежее разведение раствором АСП. Теперь нанесите свежеприготовленное разведение TSA на ткани ровно на 10 минут при комнатной температуре.
Точное время инкубации TSA имеет решающее значение. Поэтому не пытайтесь обрабатывать слишком много слайдов за раз в нашей руке. За один шаг можно обработать до 10 слайдов.
Дополнительные предметные стекла могут ждать в буфере для промывки тротила, пока они не будут обработаны после еще одного раунда промывки. Инкубируйте ткани с одной до 500 Alexa floor 5 46 striped. Принимайте его в конъюгированном состоянии в TNB в течение 30 минут.
При комнатной температуре снимите с обнаженного жителя конъюгат еще тремя тротиловыми ванночками. Затем для ядерного окрашивания нанести 5%-ный раствор BIS бензо в PBS при комнатной температуре на 10 минут, удалить пятно BIS бензо тремя промывками тротила. Затем смонтируйте предметные стекла с помощью флюорограммы Mount G и приступайте к их анализу.
С помощью описанного протокола анализировали созревание нейронных цепей, регулирующих репродуктивную ось, у мышей, несущих аллели R 26 BIZ и R 26 GTT. Экспрессия трансгенов активировалась путем критдозависимой рекомбинации в эмбриональных нейронах кисспептина в дугообразном ядре с использованием двойной иммунофлюоресценции для кисспептина в зеленом цвете и BL в красном цвете от поцелуя. IC R 26 BIZ.
Мышь показывает активацию BL в KISS IC R 26 GTT Двойная иммунофлюоресценция мыши показывает KISSPEPTIN зеленым цветом, а GTT, активированный драйвером Cree, красным. Эти и другие диагностические исследования показали, что трансгены были функциональными у экспериментальных эмбрионов E 18.5. Его пепиновые нейроны в дугообразном ядре уже были обнаружены, сообщаясь с ГНРГ.
Недостаток Z в нейронах был ограничен нейронами, экспрессирующими кисспептин, в то время как BL транссинаптически переносился на восходящие и нисходящие нейроны. Некоторые, но не все. Нейроны ГНРГ содержали bl.
Таким образом, только подмножество эмбриональных нейронов ГНРГ синаптически связано с дугообразным ядром кисспептиновых нейронов. Нейроны ГНРГ не содержали ретроградного индикатора. GTT демонстрирует, что эти нейроны находятся ниже по течению от нейронов кисспептина.
После освоения этой техники ее можно выполнить в течение одного дня после этой процедуры. Другие методы, такие как двойная иммунофлуоресценция, могут быть использованы для определения биохимической природы соединенных нейронов. Этот метод должен проложить путь исследователям в области нейробиологии и биологии развития к изучению нейронных связей с разрешением одной клетки как во время развития, так и у взрослых животных.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать формирование и созревание нейронных цепей у мышей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол трассировки нейронных цепей в мозге эмбриона мыши с использованием генетически кодируемых трансинаптических трассеров. Этот метод позволяет визуализировать развитие нейронных цепей с разрешением до одной клетки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Нейронные цепи
Теоретические основы
- Понимание механизмов формирования нейронных цепей имеет решающее значение для нейробиологии развития.
- Транссинаптические трейсеры позволяют изучать связность нейронов.
- Мозг эмбриона мыши служит моделью для изучения развития нервной системы.
- Клеточно-специфичная экспрессия трейсеров обеспечивает возможность проведения таргетного анализа.
Цель исследования
- Для визуализации развития нейронных цепей в мозге эмбриона мыши.
- Для анализа организации специфических нейронных цепей в процессе развития.
- Для предоставления протокола, применимого как к эмбрионам, так и к взрослым мышам.
Используемые методы
- Использование трех различных систем маркировки клеток.
- Применение двунаправленного транссинаптического трейсера.
- Использование ретроградного трейсера и неподвижного маркера.
- Анализ нейронных цепей с разрешением на уровне отдельных клеток.
Основные результаты
- Протокол позволяет успешно идентифицировать вышестоящие и нижестоящие нейроны.
- Результаты демонстрируют формирование нейронных цепей в мозге эмбриона мыши женского пола.
- Данный метод позволяет анализировать синаптическую активность в генетически идентифицированных нейронах.
- Он позволяет изучать влияние экспериментальных условий на нейронные цепи с течением времени.
Выводы
- Данный экспериментальный протокол эффективен для изучения развития нейронных цепей.
- Он позволяет получить представление о времени формирования и организации нейронных цепей.
- Этот метод универсален и подходит для анализа нейронных цепей как эмбрионального, так и взрослого организма.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание процесса формирования нейронных цепей в ходе эмбрионального развития дает понимание механизмов возникновения нарушений нейропсихического развития и способствует валидации мишеней при поиске лекарственных средств для ЦНС. Данный метод генетически кодируемого транссинаптического трейсинга позволяет проводить активность-зависимое картирование синаптических связей с одноклеточным разрешением, предлагая воспроизводимую систему для снижения рисков при проверке терапевтических гипотез, связанных с нейронной связностью. За счет исключения необходимости стереотаксических инъекций данный метод повышает уровень стандартизации и масштабируемости для различных этапов развития и генетических линий, обеспечивая единообразную подготовку анализов для исследований взаимодействия с мишенью.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации синаптических связей между генетически определенными популяциями нейронов в критические периоды развития.
- Практическая ценность: предоставляет генетически кодируемую систему, не требующую инъекций, которая обеспечивает стабильную экспрессию трейсера и снижает вариабельность в экспериментах по картированию нейронных цепей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные, зависимые от активности показатели транссинаптических сигналов, которые отражают функциональную синаптическую связь между вышестоящими и нижестоящими нейронами.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет Cre-зависимой, локус-специфической экспрессии из локуса ROSA26, что позволяет воспроизводимо подготавливать нейронную ткань для последующего анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков, позволяя исследователям проследить, как генетические или фармакологические воздействия влияют на формирование нейронных цепей с течением времени в эмбриональных моделях, релевантных для изучаемых заболеваний.
- Практическая ценность: предоставляет совместимый с платформой рабочий процесс, который может быть интегрирован с иммунофлуоресценцией, генотипированием и методами визуализации для многопараметрической валидации воздействия на мишень.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод поддерживает рабочие процессы раннего поиска, обеспечивая картирование нейронных цепей на основе гипотез до идентификации ведущих соединений; при этом полученные результаты позволяют оценить достоверность мишени и готовность к фенотипическому скринингу в программах по изучению нейроразвития.
- Биологические исследования: Способствуют снижению биологических рисков за счет визуализации формирования и созревания специфических нейронных цепей, таких как цепи, регулирующие репродуктивную ось, с разрешением до одной клетки.
- Скрининг: Позволяют подготавливать стандартизированные, генетически прослеживаемые нейронные системы, подходящие для оценки влияния соединений на синаптическую связность в эмбриональном или взрослом мозге.
- Аналитика: Обеспечивают получение количественных показателей на основе флуоресценции (например, перенос сигнала BL, GTT), что позволяет сравнивать синаптическую активность при различных условиях, генотипах или стадиях развития.
- Трансляционные исследования: Связывают формирование эмбриональных цепей с постнатальной функцией, позволяя проводить лонгитюдный анализ того, как нарушения на ранних этапах развития влияют на нейронную связность у взрослых особей.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Линии с двойным нок-ином ROSA26 представляют собой многократно используемую генетическую платформу, применимую к многочисленным мишеням в ЦНС и моделям заболеваний без необходимости повторного хирургического вмешательства.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, предоставляя прямые, зависимые от активности доказательства синаптических связей между генетически определенными популяциями нейронов.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость и снижает техническую вариабельность за счет Cre-зависимой, локус-контролируемой экспрессии, что исключает погрешности, связанные с инъекциями.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений по выбору мишеней в ЦНС (go/no-go), позволяя на ранних этапах визуализировать эффекты генетической или фармакологической модуляции на уровне нейронных цепей.
- Влияние на портфель: способствует продвижению проектов с учетом рисков, создавая базу механистических данных о формировании нейронных цепей, что позволяет приоритизировать мишени при нейроонтогенетических и психиатрических показаниях.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области эмбриологии мыши, генотипирования и флуоресцентной микроскопии для правильного обращения с эмбрионами, проведения секционирования и детектирования сигнала.
- Метод зависит от доступности линий с Cre-драйверами и систем флуоресцентных репортеров для клеточно-специфического мечения и мультимодальной валидации.
- Необходимы стандартизированные протоколы фиксации, криосекционирования и иммуногистохимического анализа для сохранения сигнала трейсера и обеспечения воспроизводимого качества срезов.
- Возможность адаптации метода для других модельных систем зависит от сохранности функциональности транссинаптического трейсера и специфичности промотора у видов, отличных от мышиных.
- Практические ограничения включают зависимость переноса трейсера от синаптической активности, что может повлиять на чувствительность в малоактивных или незрелых нейронных сетях.
