Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Общая цель данной процедуры заключается в получении нейральных прогениторных клеток или NPCs из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или hiPSCs в качестве платформы для изучения клеточных и молекулярных механизмов, способствующих развитию неврологических заболеваний. Это достигается путем первоначальной дифференцировки hiPSCs в нейральные розетки с использованием двойных ингибиторов smad. На втором этапе данные нейральные розетки собирают и культивируют до получения экспансируемых популяций NPC.

Затем следует лентивирусная трансдукция методом центрифугирования (spin infection). Данный этап используется для повышения эффективности манипуляций с экспрессией генов. Заключительным этапом является культивирование NPC в суспензии для их спонтанного формирования в нейросферы.

В конечном счете, данная платформа может быть использована для анализа различных клеточных фенотипов. Например, для измерения влияния генетических манипуляций на миграцию нейронов. Таким образом, этот метод позволяет получить представление о таких клеточных механизмах, как миграция.

Данный метод также может быть применен для изучения других биологических процессов, таких как репликация, окислительный стресс, апоптоз и рост нейритов. Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или высокоплюрипотентных стволовых клеток приводит к формированию видимых нейральных розеток, которые представляют собой округлые кластеры нейроэпителиальных клеток с апико-базальной полярностью, что позволяет проводить ферментативную селекцию нейральных розеток на 14-й день. Аспирируйте среду из прикрепившихся эмбриоидных телец (ebs) и добавьте по 1 mL реагента для селекции нейральных розеток в каждую лунку 6-луночного планшета; инкубируйте при 37 °C в течение одного часа.

Через один час с помощью дозатора P 1000 осторожно удалите фермент из каждой лунки и добавьте по 1 мл среды D-M-E-M-F 12 в каждую лунку. Чтобы промыть розетки, соберите 1 мл D-M-E-M-F 12 и быстро выдуйте его обратно в лунку, тем самым отделяя розетки от поверхности планшета.

Соберите розетки в коническую пробирку типа «Фалькон». Пипеткой перенесите еще 1 mL среды DMEM/F12 и быстро выдуйте ее в ту же лунку, чтобы отделить оставшиеся розетки. Не тритурируйте и старайтесь не разрушать агрегаты розеток. Соберите нейральные розетки в ту же пробирку типа «Фалькон».

Если после сбора всех нейральных розеток они не отделяются легко, можно добавить больше фермента и повторить данную процедуру. Центрифугируйте пробирку Falcon при 300 G в течение трех минут. Аспирируйте промывочный раствор и ресуспендируйте осадок.

Суспендируйте розетки в двух миллилитрах среды для нейральных стволовых клеток. Перенесите клетки в шестилуночный планшет с покрытием из поли-L-орнитина и культивируйте при 37 °C в течение одной недели. В данной лаборатории нейральные стволовые клетки (NPC) выращивают на планшетах с Matrigel, обновляют среду каждые два дня и поддерживают очень высокую плотность культуры.

Для пассирования NPC сначала аспирируйте среду, затем добавьте в каждую лунку шестилуночного планшета по 1 мл теплого аккутана и инкубируйте при 37 °C в течение 10–15 минут. Осторожно перенесите отделившиеся клетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую DMEM/F12, стараясь максимально минимизировать механическое воздействие. Не тритурируйте клетки. Осадите клетки, центрифугируя при 1000 ×g в течение 5 минут; после центрифугирования аспирируйте супернатант и ресуспендируйте NPC.

При использовании примерно 1 мл среды для NPC на одну лунку шестилуночного планшета, после ресуспендирования и подсчета клеток в каждой конфлюэнтной лунке ожидается от 5 до 10 миллионов клеток. Для поддержания культуры NPC пересаживайте в лунки шестилуночного планшета примерно от 1 до 2 миллионов клеток на лунку. Эффективность образования нейросфер варьирует в зависимости от эксперимента и клеточных линий, но обычно она максимальна, если в лунку шестилуночного неадгезивного планшета высевают от 200 000 до одного миллиона клеток; при возникновении агрегации уменьшите количество высеваемых клеток. В идеале процедуру проводят в течение одного-двух дней после пассирования.

Для увеличения процента трансфицированных клеток NP NPC следует трансдуцировать лентивирусными или ретровирусными векторами. Используйте метод спин-инфекции. Аспирируйте среду из каждой лунки и замените ее соответствующими лентивирусами или ретровирусами для сверхэкспрессии или контрольными вирусами, разведенными до требуемой множественности заражения.

В среду NPC добавьте по 1,5 миллилитров на лунку шестилуночного планшета, затем центрифугируйте в планшетной центрифуге при 1000 G и комнатной температуре в течение одного часа. После центрифугирования верните планшет в инкубатор, чтобы снизить гибель клеток. Замените среду в течение восьми часов после центрифугирования и инфицирования.

Начните выполнение данной процедуры с однократной промывки нейросфер, полученных из NPC, в среде для NPC для удаления клеточного детрита. Наклоните планшет под углом 45 градусов, дайте нейросферам осесть, после чего удалите максимально возможный объем среды, стараясь не аспирировать нейросферы. Замените среду на свежую.

Затем вручную отберите нейросферы, полученные из NPC, под микроскопом с помощью пипетки P 200, перенося по одной нейросфере в каждую лунку 96-луночного планшета, покрытого матригелем. Важно отбирать нейросферы одинакового размера, чтобы снизить вариабельность результатов. Добавьте к нейросферам в каждой лунке 96-луночного планшета дополнительные 0.5 milligrams матригеля, разведенного в холодном NPC-среде.

С помощью наконечника пипетки вручную центрируйте каждую отдельную нейросферу в середине лунки. Оставьте нейросферы для миграции на 48 часов. После фиксации и окрашивания клеток выбранными иммуногистохимическими маркерами сфотографируйте нейросферы целиком, используя объектив микроскопа Forex. Для измерения радиальной миграции используйте программное обеспечение Image J.

Используйте инструмент произвольного выделения (freehand selection tool), чтобы вручную обвести край наиболее далеко мигрировавших клеток. Убедитесь, что в окне настроек измерений (set measurements window), расположенном на вкладке «Analyze», отмечен пункт «Area». После этого используйте функцию измерения (measure), чтобы рассчитать площадь полученной фигуры.

Используя полученное значение площади и формулу площади круга, определите внешний радиус аналогичным образом, обведя край исходной нейросферы. Измерьте площадь и вычислите внутренний радиус. Рассчитайте общую радиальную миграцию как разность между внешним и внутренним радиусами.

На этих изображениях показаны этапы высокоэффективной нейральной дифференцировки высокопотентных стволовых клеток (PSC): от PSC к эмбриоидным тельцам, нейральным розеткам, нейральным клеткам-предшественникам (NPC) и нейронам. Валидация показала, что NPC экспрессируют маркер Nestin и транскрипционный фактор нейральных стволовых клеток SOX2 в большинстве клеток. Окрашивание на бета-III-тубулин также наблюдается во всех популяциях NPC. Кроме того, NPC экспрессируют транскрипционный фактор нейральных стволовых клеток PAX6 и маркер предшественников мозга FoxG1.

НПК, экспрессирующие TBR2, но не маркеры среднего мозга, такие как LMX1A и FOXA2, могут дифференцироваться в 70–80% β3-тубулин-положительных нейронов (показаны зеленым) и 20–30% глиальный фибриллярный кислый белок-положительных астроцитов (показаны красным) при высоком качестве ПСК. НПК высокого качества экспрессируют nestin и SOX2 в большинстве клеток, тогда как НПК низкого качества имеют лишь отдельные участки SOX2-отрицательных и nestin-отрицательных клеток. Четырехнедельные нейроны, дифференцированные из высококачественных НПК, экспрессируют MAP2AB и β3-тубулин.

После успешной трансдукции лентивирусным или ретровирусным вектором с высоким титром более 80% клеток будут мечены флуоресцентным репортером. Использование данного вектора при генерации нейросфер позволяет получить популяцию нейросфер относительно однородного размера, которые могут оставаться жизнеспособными в культуре в течение примерно одной недели.

При регулярном кормлении миграция нейросфер протекает активно в здоровых нейросферах, что показано на этих изображениях в светлом поле до и после 48 часов миграции в матригеле после его формирования. Данная методика открыла исследователям в области шизофрении возможность изучать нейромиграцию в NPC, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Не забывайте, что работа с ретровирусом может быть потенциально опасной, и все работы с культурами тканей должны проводиться в условиях BL 2+, если предполагается наличие вируса.