Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Общая цель этой процедуры заключается в создании нейроклеток-предшественников или NPC из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или с высоким содержанием ПСК в качестве платформы для изучения клеточных и молекулярных механизмов, способствующих развитию неврологических заболеваний. Это достигается путем предварительной дифференциации высоких ПСК с использованием двойных ингибиторов smad в нейронные розетки. Второй шаг состоит в том, чтобы собрать эти нейронные розетки и позволить им вырасти в расширяемые популяции N ПК.

Далее лентивирусная трансдукция со спиновой инфекцией. Шаг к повышению эффективности используется для манипулирования экспрессией генов. Последний шаг — выращивание NPC во взвешенном состоянии, чтобы они спонтанно формировали нейросферы.

В конечном счете, эта платформа может быть использована для анализа различных клеточных фенотипов. Например, измерение влияния генетических манипуляций на нейромиграцию. Хотя этот метод может дать представление о клеточных механизмах, таких как миграция.

Он также может быть применен для изучения других биологических процессов, таких как репликация, окислительный стресс, апоптоз и рост нейритов. Дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток или высоких ПСК приводит к образованию видимых нейронных розеток, которые характеризуются как круглые скопления нейроэпителиальных клеток с базальной полярностью AICO для ферментативного отбора нейронных розеток на 14-е сутки. Аспиратуйте среды из прилипших тел эмбрионов или ЭБС и добавьте один миллилитр реагента для отбора нейронных розеток в лунку шестилуночного планшета, инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.

Через час. С помощью пипетки P 1000 аккуратно удалите фермент из каждой лунки и добавьте один миллилитр D-M-E-M-F 12 на лунку. Чтобы промыть розетки, соберите один миллилитр D-M-E-M-F 12 и быстро вытолкните его обратно в колодец, таким образом отделив розетки от тарелки.

Соберите розетки в соколиную трубку пипеткой еще один миллилитр D-M-E-M-F 12 и быстро вытолкните его в ту же лунку, чтобы отделить оставшиеся розетки. Не пытайтесь и старайтесь не разбивать агрегаты розетки. Соберите нервные розетки в ту же соколиную трубку.

Можно добавить больше фермента и повторить эту процедуру, если розетки не отделяются легко, когда все нейронные розетки собраны. Вращайте трубку Falcon при 300 G в течение трех минут. Отсадите жидкость для промывки и восстановите ее.

Суспензируйте розетки в двух миллилитрах нейронных прогениторных клеточных сред. Перенесите ячейки в шестистеночную пластину с покрытием из полиорнитинового ламината и выращивайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной недели. В этой лаборатории нейральные клетки-предшественники или NPC выращиваются на матригелевых пластинах, скармливаются каждый второй день и поддерживаются на очень высоком уровне.

Чтобы разделить NPC, сначала аспирируйте среду, а затем добавьте один миллилитр теплого аккутана на лунку шестилуночного планшета, инкубируемого при 37 градусах Цельсия в течение 10-15 минут. Аккуратно перенесите отделенные клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую D-M-E-M-F 12, с минимальным механическим воздействием. Не тритируйте клетки во время нахождения в ферменте гранул путем вращения при 1000 G в течение пяти минут после центрифугирования, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте NPC.

Примерно в одном миллилитре NPC-среды на исходную лунку шестилуночного планшета ожидается от 5 до 10 миллионов клеток на конфлюентную лунку шестилуночного планшета после ресуспендирования и подсчета клеток. Переведите пластину NPC примерно от одной до 2 миллионов клеток на лунку шестилуночной пластины для поддержания NPC. Эффективность образования нейросфер варьируется в зависимости от эксперимента и клеточных линий, но обычно лучше всего происходит, если от 200 000 до миллиона клеток сидят в лунке шестистенной неадгезивной пластины.

NPC следует трансдуцировать лентивирусными или ретровирусными векторами для увеличения процента трансфицированных клеток. Используйте спиновую инфекцию. Отсасывайте среду из каждой лунки и заменяйте соответствующими сверхэкспрессирующими или контрольными лентивирусами или ретровирусами, титрованными до желаемой кратности разбавленной инфекцией.

В среде NPC используйте 1,5 миллилитра на лунку шестилуночного планшета при 1000 G и комнатной температуре в течение одного часа в планшетной центрифуге. После отжима поместите планшет обратно в инкубатор, чтобы уменьшить гибель клеток. Замените фильтрующий материал в течение восьми часов после заражения спином.

Начните эту процедуру с однократного промывания нейросфер, полученных от NPC, в среде NPC для удаления клеточного мусора. Наклоните пластину под углом 45 градусов и дайте нейросферам осесть, а затем удалите как можно больше сред, не отсасывая нейросферы. Замените на свежий носитель.

Затем вручную выберите нейросферы, полученные от NPC, под микроскопом с помощью пипетки P 200 и перенесите по одной нейросфере в каждую лунку 96-луночного планшета, покрытого матригелем. Важно подбирать нейросферы схожих размеров, чтобы уменьшить вариабельность результатов. Добавьте дополнительно 0,5 мг геля матри, разведенного в холодной среде NPC, в нейросферы в каждой 96-луночной пластине.

С помощью наконечника для пипетки вручную центрируйте каждую отдельную невросферу в середине лунки Позвольте миграции невросферы происходить в течение 48 часов. После фиксации и окрашивания клеток нужными иммуногистохимическими маркерами сфотографируйте нейросферы целиком с помощью объектива микроскопа Форекс. Для измерения радиальной миграции используйте программное обеспечение image J.

Используйте инструмент выделения от руки, чтобы вручную обвести край самых дальних мигрирующих ячеек. Убедитесь, что эта область отмечена в окне набора измерений, расположенном на вкладке «Анализ». А затем используйте функцию measure для вычисления площади полученной фигуры.

Используйте значение измерения площади и уравнение для площади круга, чтобы точно так же определить внешний радиус, проведите по краю исходной невросферы. Измерьте площадь и рассчитайте внутренний радиус. Рассчитайте общую радиальную миграцию как разницу между внешним и внутренним радиусами.

На этих изображениях показаны стадии нейронной дифференцировки с высоким уровнем ПСК от высоких ПСК до тел эмбрионов, экспрессия NPC в нейронных розетках, NPC и подтвержденная экспрессия NPC, вложение маркера NPC и фактор транскрипции нейронных стволовых клеток SOX в большинстве клеток. Окрашивание бета-3 тубулина также заметно во всех популяциях NPC. NPC также экспрессируют фактор транскрипции нервных стволовых клеток PAC six и маркер-предшественник четырех brainin.

TBR два, но не маркеры среднего мозга, такие как LMX one A и FOX A два NPC, могут дифференцироваться до 70-80% бета-трех тубулин-положительных нейронов, показанных зеленым цветом, и от 20% до 30% глиальных фибриллярных кислых белков-положительных астроцитов, показанных красным, высокого качества с высоким содержанием PSC. NPC экспрессируют нестон и SOX 2 в большинстве клеток, в то время как NPC низкого качества имеют участки SOX 2 отрицательные и гнездятся только в отрицательных клетках. Четырехнедельные нейроны, дифференцированные от высококачественных NPC, экспрессируют турбулентную карту 2 AB и бета 3

После успешной трансдукции лентивирусным или ретровирусным вектором с высоким титром. Более 80% клеток помечены флуоресцентным репортером. Включенная в вектор генерация неврозов дает популяцию нейросфер относительно однородного размера, которая может оставаться здоровой в культуре в течение примерно одной недели.

При регулярном питании нейросфера миграция происходит устойчиво в здоровых нейросферах, как показано на этих светлопольных изображениях до и после 48 часов миграции в матери После ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области шизофрении к изучению нейромиграции в индуцированных человеком NPC, полученных из стволовых клеток PL. Не забывайте, что работа с ретровирусом может быть потенциально опасной, и вся работа по культивированию тканей должна проводиться в условиях BL two plus, когда вирус потенциально присутствует.