Манипуляция и In Vitro Созревание Xenopus Laevis ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

Целью данного эксперимента является сбивание материнских белков, хранящихся в ооцитах, или сверхэкспрессия представляющих интерес белков в момент оплодотворения яйцеклеток лягушки. Это достигается путем введения антисмысловых олигон или мРНК в ферментативно дерегулированные незрелые ооциты для деградации или сверхэкспрессии определенного белка. На втором этапе ооциты переводятся в среду, содержащую прогестерон, которая индуцирует созревание ооцитов до яйцеклеток.

Затем сперматозоиды вводятся в созревшие яйцеклетки in vitro для того, чтобы наблюдать за влиянием нокдауна или сверхэкспрессии на эмбриональное развитие. В конечном счете, развитие олигоинъекционных ооцитов плавающим головастикам является функциональным испытанием нокдауна или сверхэкспрессии генов. Основное преимущество этой методики перед существующими сосудами типа host to transfer, заключается в том, что мы можем пропустить процесс операции с лягушкой, используя стандартные протоколы.

Соберите опус над SAC, содержащим здоровые циты, в девятисантиметровой петрочашке, содержащей MBS плюс ps. Затем раздразните завязь на квадратные кусочки шириной от одного до двух сантиметров. Соберите около пяти миллилитров разорванного яичника с помощью цитов в новую 50 миллилитровую трубу.

Затем несколько раз промойте салфетки MBS plus PS, и соберите яйца по 15 миллилитров свежего MBS plus ps. Теперь добавьте в суспензию семь единиц фермента дефолиации и инкубируйте суспензию с нежной растительностью до тех пор, пока она не будет хотя бы частично дефолиирована. На это уйдет не менее часа после инкубации.

Заполните пробирку MBS plus Ps, чтобы остановить реакцию. Вытягивайте раствор на стенку трубки, а не непосредственно на циты. Дайте тканям осесть и выбросьте суп и средство.

Маленькие, незрелые клетки будут плавать, и их также следует выбросить. Повторите этот шаг промывки в общей сложности 10 раз после стирки. Перенесите циты в девятисантиметровую тарелку с MBS плюс пс.

Перенесите чашку в препарирующий микроскоп и отсюда поддерживайте температуру в цитах на уровне от 16 до 18 градусов Цельсия, насколько это возможно. Выберите циты шестого этапа хорошего качества с помощью классификации Дюмона с помощью стеклянной пипетки, соберите их в новую чашку с MBS плюс пс. Цит хорошего качества должен иметь равномерную пигментацию в полушарии животного и демонстрировать четкое разделение между животным и растительным полушариями.

Они также должны быть примерно одинакового размера, который будет составлять от 1,2 до 1,4 миллиметра в диаметре. Соберите от двух до 300 цитов для каждой инъекции, что составляет около 1000 цитов за эксперимент. Качество сайта О – залог успеха.

Если у Озиде проявляются какие-либо отклонения во время подготовки, я рекомендую вам исправить яичник из другого стада и начать сначала. При подготовке к введению антисмыслового олигопласта установите металлический поршень микроинжектора в самое нижнее положение и вставьте стеклянный капилляр, наполненный маслом, на металлический поршень. Под диссекционным микроскопом разрежьте кончик иглы с помощью небольших хирургических ножниц.

Сделайте чаевые как можно меньшего размера. Следующий лазер. Полоску параформы на предметный столик микроскопа и на нее выдают три микролитра раствора нуклеиновой кислоты из расчета один микрограмм на микролитр.

Этим заполните кончик иглы. Если воздух задерживается, отверстие следует сделать больше. Теперь сделайте видимую отметку на игле для инъекции примерно в полумиллиметре от кончика.

Затем приступайте к введению цитов, чтобы сначала ввести одну, найдите область, свободную от клеток фолликула, куда игла может проникнуть в эту область. Вставьте наконечник вдоль экваториальной границы, нацелившись на центральную точку под зародышевым пузырьком. Одновременно стабилизировать цит щипцами с противоположной стороны.

Теперь с помощью ножного переключателя выведите раствор, выбросьте от 4,6 до 9,2 нанограммов антисмысловых олигонотид или от 250 пикограмм до 13,8 нанограммов матричной РНК. После введения всех цитов переведите их в инкубационную среду и дайте им инкубироваться несколько дней, чтобы могли произойти изменения. В протеасоме.

Позже перенесите циты с минимальным количеством среды в шестисантиметровую посуду, покрытую агросовой облицовкой, содержащую пять-восемь миллилитров среды для созревания. Затем дайте цитам развиваться в этой среде в течение 16 часов, прежде чем вводить им сперму. Для этого протокола необходимо подготовить замороженный запас спермы.

Обратитесь к текстовому протоколу через 16 часов инкубации для созревания. Очень осторожно переложите циты в шестисантиметровую яйцо, покрытую галочкой с MBS плюс PS, чтобы смыть их. Если циты неправильно обработаны, они могут спонтанно активироваться до икси.

Теперь подсчитайте созревшие циты и ищите белые пятна, которые указывают на то, что зародышевый пузырь цита разрушился. Если менее 80% здоровы, они в совокупности недостаточно здоровы, чтобы пережить процедуру ixy. Чтобы продолжить.

Наполните новую посуду инъекционным средством и аккуратно перенесите все циты в посуду через полчаса. Продолжайте вводить в зрелые циты раствор сперматозоида с использованием того же инжекторного препарата, который описан для олигонухозов. В идеале в растворе для инъекций должен быть один или два сперматозоида на 4,6 нанолитра.

Чтобы протестировать этот раствор для инъекций, сделайте капли раствора DPI с концентрацией 0,3 микрограмма DPI на миллилитр и введите в эти капли 4,6 нанолитра. Затем подсчитайте количество сперматозоидов в каждой капле с помощью флуоресцентной микроскопии. После подтверждения концентрации сперматозоидов введите в циты 4,6 нанолитра раствора спермы.

Убедитесь, что время, необходимое для введения растворов, остается постоянным, и вводите ооциты стабильно с минимальными паузами между инъекциями. После каждых 100 инъекций обмена, раствор спермы. После того, как все созревшие ооциты были введены, чашку следует инкубировать в течение четырех-пяти часов, затем осмотреть.

У эмбрионов, подвергшихся расщеплению, борозды расщепления могут быть не такими четкими, как у нормальных оплодотворенных эмбрионов, переносят все расщепленные эмбрионы в инкубационные среды и дают им инкубироваться в течение ночи. На следующий день выжившие эмбрионы должны быть переведены на 0,1 XMMR эмбриональное развитие ixy эмбрионов. Использование зрелых яйцеклеток in vitro было исследовано в хороших экспериментах, почти 100% ооцитов зародышевых пузырьков отреагировали на прогестерон и показали признаки созревания.

От 60 до 80% расщепленных эмбрионов достигли стадии взрывного состояния, а около трети из них достигли стадии плавательного головастика. Эмбрионы икси представляли собой смесь нормальных и аномальных эмбрионов, что свидетельствует о том, что инъекция антисмыслового сого в зародышевые векальные цитаты с последующим проведением IVM и Dixie позволила добиться раннего эмбрионального развития.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как манипулировать материнскими белками перед факторизацией.