Экспериментальная оценка мыши Общительность с помощью автоматизированной обработки изображений подход
15 мая 2016 г.
Этот протокол описывает метод количественной оценки мыши коммуникабельность. Мыши на видеопленку, как они двигаются и взаимодействуют в специальной клетке. Обработка Movie позволяет автоматизированной количественной оценки общительности с высокой точностью и надежностью.
Общая цель этих поведенческих экспериментов в сочетании с автоматическим анализом состоит в том, чтобы количественно оценить общительность мышей эффективным по времени способом. Этот метод может помочь в быстром скрининге лекарств для повышения общительности в валидированных мышиных моделях расстройств аутистического спектра. Основное преимущество внедрения автоматизированного анализа заключается в том, что он ускоряет процесс и делает скрининг более эффективным.
Потребность в автоматизированном методе оценки социального поведения мышей возникла из-за того, что визуальный скрининг в режиме реального времени одной дозы соединения-кандидата занимает более 50 часов. Позже в видео мой аспирант Френси Варгезе продемонстрирует автоматизированный анализ. Начните с установки трехкамерной клетки с черными стенками.
Для первого сеанса поместите пустую чашку из перевернутой проволоки в каждый торцевой отсек клетки. Теперь подготовьте видеокамеру для обзора клетки сверху. Все три отсека должны быть видны с разрешением не менее 720 на 480 пикселей.
Затем подсвечивайте клетку непрямым освещением накаливания так, чтобы интерьер клетки при измерении от пола имел не более 3,5 люкс. Также обеспечьте инфракрасный свет для освещения клетки на уровне, который может обнаружить камера. Сделайте однокадровое изображение пустой клетки для справки.
Для первого сеанса поместите тестовую мышь в клетку. Затем для постановки в очередь автоматизированного анализа видео помашите рукой над клеткой всего один раз. Дайте мыши исследовать испытательную клетку в течение 10 минут.
Затем верните его в домашнюю клетку. Для второго сеанса поместите мышь под одну из двух перевернутых чашек. Выберите чашку в качестве противовеса.
В программном обеспечении укажите, под какую чашку была помещена мышь-стимул. В соответствии с соглашениями об именовании, чашка, содержащая закрытую мышь, является социальной чашкой, в то время как другая чашка является несоциальной. Отсеки названы аналогичным образом.
Поставьте начало второго сеанса в очередь, взмахнув рукой, как во время первого сеанса. В конце второго сеанса снимите перевернутые чашки, чтобы освободить вторую мышь. Используйте еще один взмах руки, чтобы обозначить начало третьего сеанса, и позвольте двум мышам взаимодействовать в тестовой клетке в течение 10 минут.
Через 10 минут верните обеих мышей в их домашние клетки. В этом разделе объясняется, как обрабатывать фильмы с помощью пользовательского интерфейса. Тем не менее, возможен и быстрый анализ в пакетном режиме без ввода данных пользователем.
Начните с загрузки фильма с помощью кнопки «Загрузить». Затем выберите конфигурацию клетки. Программа анализа определяет границы клетки, отсеки и чашки.
Выберите одну из четырех предустановленных конфигураций или настройте координаты вручную. Теперь для каждого кадра фильма выполните следующие шаги обработки. Сначала преобразуйте кадры в оттенки серого.
Во-вторых, вычитаем систему отсчета оттенков серого, созданную во время подготовки, тем самым обнуляя значения пикселей везде, кроме позиции мыши. В-третьих, бинаризуйте кадры, установив все пиксели выше пороговой яркости в белый цвет и сделав все остальные черными. Отрегулируйте эту настройку в соответствии с условиями освещения.
Теперь удалите хвост с изображений с помощью функции Эрозия/Расширение. Сначала размывайте бинаризованную картинку три раза. Затем расширьте рамку в шесть раз.
Затем вымывайте рамы еще три раза. Это может потребовать корректировки, если используется другое разрешение в пикселях. Волны рук легко идентифицировать как огромные скачки в объеме белых пикселей.
Это позволяет автоматически определять начало сеанса и порядок сеансов. В каждом сеансе определяйте наибольший компонент белых пикселей с помощью команды L/Comp. При этом удаляются пиксели, которые не принадлежат мыши.
Затем используйте функцию «Найти концы», чтобы определить два самых удаленных пикселя в самом большом компоненте белых пикселей. Это нос и хвост. Программное обеспечение определяет центр тяжести или COG для белого пиксельного объекта и вычисляет направление его движения от кадра к кадру.
Для сеансов с двумя мышами необходимо отслеживать два объекта. Выделите и сориентируйте два самых больших белых пиксельных объекта с помощью одного и того же набора команд. Программное обеспечение автоматически проверяет COG от кадра к кадру.
Если какой-либо объект изменяется в размере более чем на 20% или центр тяжести перемещается дальше, чем это возможно для мыши, то порог бинаризации автоматически увеличивается до тех пор, пока эти критерии не будут выполнены. Программное обеспечение автоматически проверяет центры тяжести от кадра к кадру. Если какой-либо объект изменяется в размерах более чем на 20% или центр тяжести перемещается дальше, чем это возможно для мыши, то порог бинаризации автоматически корректируется до тех пор, пока эти критерии не будут выполнены.
Взаимодействия обнаруживаются автоматически, когда объекты находятся в пределах двух сантиметров. Эти сегменты воспроизводятся для ввода данных пользователем. Для каждого сегмента обозначьте точку зрения тестовой мыши как «Социальное избегание», «Социальный подход» или «Ни то, ни другое».
Для проверки автоматического анализа загрузите фильм с помощью кнопки Загрузить. Затем нажмите «Начать сеанс 1», чтобы отобразить первый кадр этого сеанса. Используйте команду «Воспроизведение/Стоп» для управления воспроизведением.
Обработанные видеоролики показывают каждую мышь с кругом разного цвета на голове и хвосте. Кроме того, показатели общительности отображаются на экране и обновляются во время воспроизведения. Исправьте любые ошибки, возникшие при автоматическом анализе.
Самая распространенная ошибка — это переброс головой и хвостом, который можно исправить с помощью инструмента на интерфейсе. Это происходит примерно в 20% видео. В редких случаях более сложных ошибок их обычно можно решить, вручную указав расположение носа мыши в определенной серии видеокадров.
После проверки экспортируйте данные о коммуникабельности в формат электронной таблицы с помощью функции «Экспорт». Чтобы экспортировать данные из нескольких фильмов в виде одной таблицы, фильмы должны быть объединены в одну папку, и эту операцию выполняет функция «Компилировать данные». В первом сеансе четырехнедельная тестовая мышь BALB/c перемещалась между отсеками 59 раз в течение 10 минут.
Время, проведенное в каждом отсеке, считается базовым уровнем для предпочтения отсека без социальных стимулов. На втором занятии социальный и несоциальный кубок был подарен спрятанной четырехнедельной мышью ICR. Наблюдался явный перекос в сторону проведения времени в социальном отсеке.
В частности, мышь проводила больше времени с социальной чашкой, чем с несоциальной. На третьем сеансе чашки были подняты, и мышам было позволено взаимодействовать. Всего за 10 минут было сделано 35 социальных подходов.
После его разработки этот метод способствует более быстрому скринингу перспективных препаратов для улучшения основной симптоматической области нарушения общительности в валидированных мышиных моделях расстройств аутистического спектра. Автоматизированная обработка может быть адаптирована к различным конструкциям клеток и типам. Любое поведение, представляющее интерес, может быть оценено при условии разработки алгоритма для его надежного обнаружения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод количественной оценки социальности мышей с помощью автоматизированного анализа видеозаписей. Этот подход повышает эффективность скрининга социальности в моделях расстройств аутистического спектра у мышей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческий анализ
- Исследования аутизма
Теоретические основы
- Оценка социальности мышей имеет решающее значение для понимания социального поведения.
- Традиционные методы требуют больших затрат времени и трудозатрат.
- Автоматизированный анализ может значительно сократить время, необходимое для оценки социальности.
- Данный метод особенно актуален для скрининга препаратов в исследованиях аутизма.
Цель исследования
- Разработать экономичный по времени метод количественной оценки общительности у мышей.
- Обеспечить возможность быстрого скрининга соединений, которые могут повышать общительность.
- Повысить точность и надежность оценки общительности.
Используемые методы
- Видеозапись мышей в специально сконструированной трехкамерной клетке.
- Автоматизированная обработка видеоданных для количественной оценки общительности.
- Сравнение результатов с традиционными методами визуального скрининга.
- Демонстрация процесса автоматизированного анализа.
Основные результаты
- Автоматизированный метод обеспечивает точные и надежные измерения социальности.
- Значительно сокращает время, необходимое для оценки социальности.
- Обеспечивает эффективный скрининг препаратов на моделях мышей.
- Продемонстрированная эффективность в условиях реальной экспериментальной установки.
Выводы
- Автоматизированный анализ является ценным инструментом для оценки социальности мышей.
- Данный метод может ускорить исследования расстройств аутистического спектра.
- Будущие исследования могут опираться на этот подход для дальнейшего изучения поведения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Автоматизированное количественное определение социальности мышей позволяет проводить быстрый скрининг соединений, направленных на устранение дефицита социального поведения в валидированных моделях расстройств аутистического спектра. Сокращая время оценки с более чем 50 часов на одну дозу до эффективной пакетной обработки, этот метод обеспечивает высокопроизводительную валидацию мишеней и идентификацию ведущих соединений. Он предоставляет количественные, воспроизводимые показатели поведения, которые повышают прогностическую достоверность при принятии решений на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет количественно оценить социальность по времени, проведенному рядом с социальными и несоциальными стимулами, а также по количеству социальных приближений, что дает возможность механистического анализа терапевтических гипотез.
- Практическая ценность: автоматизированное отслеживание положения носа и анализ движений позволяют отказаться от ручного подсчета, что увеличивает пропускную способность и снижает межоператорскую вариабельность.
- Прогностическая ценность: позволяет получить показатели социальности с дозозависимым ответом, что способствует снижению рисков при выборе мишеней и приоритизации портфеля препаратов при разработке лекарств для ЦНС.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Стандартизированный трехкамерный аппарат с автоматизированным видеоанализом создает воспроизводимую платформу для оценки социальности.
- Количественные показатели: Измеряются переходы между камерами, время пребывания в социальной зоне, а также случаи социального сближения/избегания в качестве непрерывных переменных для скрининга соединений.
- Масштабируемость: Возможность пакетной обработки позволяет параллельно оценивать несколько соединений, что способствует переходу от стадии поиска хитов к оптимизации лидов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Позволяет напрямую моделировать нарушение социальности — основной симптом расстройств аутистического спектра, что обеспечивает согласованность трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: Обеспечивает возможность лонгитюдной оценки изменений в социальном поведении при различных режимах лечения на валидированных моделях мышей.
- Принятие решений с учетом рисков: Объективные данные о социальности позволяют принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), снижая неопределенность механизмов формирования поведенческих фенотипов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях через идентификацию перспективных соединений до оценки доклинической эффективности, предлагая использовать социальность в качестве количественного конечного показателя для соединений, модулирующих социальное поведение.
- Открывательная биология: позволяет проводить проверку гипотез о механизмах социальности путем количественной оценки предпочтения социального взаимодействия и поведения при сближении.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных автоматизированных показателей социальности, что способствует воспроизводимости анализа и сравнению соединений между разными планшетами и днями.
- Аналитика: генерирует числовые индексы социальности (время, переходы, количество сближений), что упрощает статистический анализ и моделирование взаимосвязи «структура — активность».
- Трансляционные исследования: обеспечивают клиническую значимость путем моделирования основного диагностического домена аутизма, поддерживая доклиническую валидацию, согласованную с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: автоматизированный рабочий процесс адаптируется к различным конструкциям клеток и видам животных, что позволяет применять его в разных программах поведенческой фармакологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает объективные количественные показатели социального поведения, что снижает субъективность и повышает уверенность в воздействии на целевой объект.
- Операционная ценность: Автоматизация сокращает время непосредственной работы над каждым анализом с нескольких часов до нескольких минут, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг.
- Стратегическая ценность: Ускоряет оптимизацию соединений-лидеров за счет оперативного получения данных о социальном поведении, что повышает эффективность использования капитала в программах по изучению ЦНС.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе надежных профилей социального поведения в моделях, соответствующих патологии заболевания.
Особенности реализации
- Для настройки и валидации требуются экспертные знания в области поведенческой нейробиологии и алгоритмов видеотрекинга.
- Для надежного детектирования носа необходимы стандартизированное освещение, возможность работы в инфракрасном спектре и камера с минимальным разрешением 720x480.
- Требуется соблюдение единообразной длительности сессий и сбалансированное размещение стимулов для исключения позиционного смещения.
- Необходимо ручное подтверждение ориентации «голова-хвост» примерно в 20% видеозаписей для исправления ошибок автоматического трекинга.
- Точность трекинга при различных условиях освещения и разных линиями мышей зависит от настройки порога бинаризации.
