Определение мембранного белка топологии с помощью флуоресцентной протеазы Защита (FPP)

Общая цель этой процедуры заключается в определении топологии интегральных мембранных белков. Это достигается за счет экспрессии выпота, белка между зеленым флуоресцентным белком или GFP и амино- или карбоксильными хвостами мембраны. Белок, представляющий интерес в клетках для целей контроля, могут экспрессироваться растворимые флуоресцентные белки, такие как RFP.

Далее плазматическая мембрана подвергается избирательному проникновению. С помощью детергентного средства растворимые флуоресцентные белки будут покидать клетку, в то время как связанные с мембраной флуоресцентные белки будут сохраняться внутри клетки. Заключительным этапом является нанесение протеазы на клетки пермы и определение сохранения или потери флуоресцентного сигнала.

В конечном счете, изменения интенсивности флуоресценции, наблюдаемые с помощью флуоресцентной микроскопии, используются для демонстрации топологии и ориентации интегральных мембранных белков. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как картирование эпитопов, заключается в том, что процедура не требует большого количества специализированного оборудования или различных реагентов, которые может быть трудно достать. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии мембранных белков, например, какие домены интегрального мембранного белка могут быть расположены в цитозоле, а какие домены могут быть расположены в просвете органелл, таких как эндоплазматический ретикулум золота G или эндосомы.

Начните эту процедуру с получения и валидации флуоресцентного белка KY, как описано в текстовом протоколе. Затем флуоресцентный белок KY трансфицируют в эмбриональные клетки почек человека или клетки HEK 2 93 с использованием любого стандартного высокоэффективного метода трансфекции с низкой токсичностью, включая липидные, вирусные или электропорационные технологии для получения переходной или стабильной экспрессии. Выдерживайте клетки в течение от пяти до 48 часов в соответствующей среде для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур, способном получать углекислый газ.

Контролируйте клетки на экспрессию гибридного белка GFP с помощью эпифлуоресцентной микроскопии, и внутренний флуоресцентный сигнал GFP флуоресцентного сигнала обычно достигает максимума в течение 24-72 часов. После трансфекции. Использование клеток, когда флуоресцентный сигнал достигает максимального уровня, экспрессия белка также может контролироваться с помощью иммуноблоттинг-анализа с использованием антител, направленных либо против представляющего интерес белка, либо против группы GFP.

Для начала наладка перфузионной системы с гравитационной подачей для обработки клеток. Подготовьте 50 миллилитровые шприцы для растворов с полиэтиленовой трубкой, которая подключается к независимым резервуарам и к коллектору с одним выпускным отверстием в ванне. Расположите всасывающий пипетку так, чтобы поддерживать постоянный объем ванны и обеспечить замену раствора путем ручного переключения между перфузионными резервуарами для проникновения плазматической мембраны.

Во-первых, удалите из клеток питательную среду для клеточных клеток. Промойте ячейки трижды по одной минуте каждая. В буфере KHM поместите защитные стекла на предметный столик флуоресцентного микроскопа и соберите первое изображение, которое представляет собой контрольное непроницаемое изображение для избирательного проникновения в плазматическую мембрану.

Добавьте к клеткам пальцы в буфере KHM, перфузируйте ячейки с буфером плюс пальцы со скоростью пять миллилитров в минуту в течение 10-60 секунд. Подтверждение того, что плазматическая мембрана обладает адекватной проницаемостью, легко осуществляется путем экспрессии растворимой молекулы GFP или RFP, которая будет легко диффундировать из клетки после мембраны. Затем проникновение подтверждает, что представляющий интерес химер белка GFP интегрирован в мембрану, подтверждая клеточное удержание флуоресцентного сигнала после дигона и проникновения через плазматическую мембрану.

Затем экспрессируйте органический специфический флуоресцентный белок, такой как митохондриальный белок, как указано в текстовом протоколе. Определите оптимальные условия сцеживания, как и раньше. Подтвердить, что раскопка и концентрация соответствуют используемому типу клеток, убедившись, что морфология внутриклеточных каналов органов остается постоянной при длительном воздействии.

Копать тоин. После промывки клеток в буфере KHM добавьте протеазу непосредственно на клетки. Изучайте клетки со скоростью потока пять миллилитров в минуту, используя систему перфузии с гравитационной подачей для непрерывного купания препарата.

Затем определите, сохраняется ли флуоресцентный сигнал или он ослабевает. Собирайте изображения флуоресцентной микроскопии под соответствующими наборами фильтров с помощью функции захвата видеоизображений на флуоресцентном микроскопе с компьютерным управлением. Количественно оценивайте интенсивность флуоресцентного сигнала в зависимости от условий инкубации.

Получение средней интенсивности пикселей в пределах интересующей области, которая окружает отдельную ячейку. Потеря более 90% от начальной интенсивности сигнала в течение 30-60 секунд согласуется с протеолитической деградацией белка GFP ky. Полное исчезновение растворимого флуоресцентного сигнала должно произойти в течение 10-60 секунд после нанесения пальца.

Подтверждение того, что интересующий нас белок связан с внутриклеточными органеллами, достигается путем наблюдения за сохранением флуоресцентного сигнала после дигона и проникновения. Карбоксильный хвост мембранной киназы LTK two был слит с GFP и экспрессировался временно флуоресцентным LTK. Сигнал GFP два был быстро потерян после добавления протеиназы К, что указывает на расположение карбоксильного конца LTK 2 в цитозоле.

Cavi and GFP — это белок плазматической мембраны с фрагментом GFP, присоединенным к цитозольному домену. Как и в случае с LTK 2, сигнал от cavi и GFP нечувствителен к пальцам, но чувствителен к последующему добавлению протеазы DS red mito кодирует красный флуоресцентный белок, слитый с митохондриальной последовательностью-мишенью из цитохром С-оксидазы после проникновения дигона, а также добавление протеиназы K. Флуоресценция, связанная с красным мито DS, остается стабильной. Это согласуется с тем, что Fluor 4 находится в митохондриях, где он не подвергается воздействию цитозола.

Когда флуоресцентная группа, прикрепленная к мембранному белку, обращена к клетке наружу, как в GPI, закрепленном прионном белке, прикрепленном к желтому флуоресцентному белку. Лечение протеиназами должно быстро гасить флуоресцентный сигнал без предварительной необходимости проникновения внутрь, как ожидалось. После лечения протеиназами внеклеточный флуоресцентный сигнал быстро исчезал для клеток, экспрессирующих эту конструкцию.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один-два часа, если все сделано правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться более глубокое понимание того, как определить топологию интересующего вас мембранного белка.