Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как выполнить быстрое иммуномечение популяции клеток мозга мыши, выделенной с помощью микродиссекции лазерного захвата или LCM, сохраняя при этом целостность РНК образцов. Это достигается путем быстрого замораживания сначала рассеченной мозговой ткани. Затем мозг разрезают на тонкие срезы на предметных стеклах микроскопа без РНК и обрабатывают быстрым иммуноокрашиванием.

Наконец, представляющая интерес популяция клеток изолируют с помощью ЖКМ. В конечном счете, быстрое окрашивание с последующим микродиссекцией с лазерным захватом позволяет идентифицировать изменения в экспрессии интересующего гена в экспериментальном образце клетки. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как сортировка флуоресцентных активированных клеток, заключается в том, что с помощью нашей методики сохраняется пространственное разрешение, позволяющее растворять специфическую клетку ЭС из окружающей ткани.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой клеткой Смита, будут кружиться, потому что эта процедура включает в себя несколько критических шагов, требующих быстрой работы для поддержания целостности РНК в образцах. Чтобы подготовить образцы для разрезания, препарируйте мозг мышей первого дня после рождения в ледяной среде L 15 в течение двух минут после жертвоприношения. Далее поместите мозги в закладные формы в соответствующей ориентации для разрезания и заполните формы замороженной тканью, закладывая среды.

Затем немедленно заморозьте образцы в жидком азоте и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение 30 секунд после мгновенной заморозки. Теперь обработайте предметные стекла с мембранным покрытием с помощью обеззараживания поверхностной РНК, чтобы удалить любые следовые количества РНК. Промойте их в воде DEPC и дайте им высохнуть на воздухе, когда слайды высохнут.

Установите температуру в криостатной камере на отметку минус 20 градусов Цельсия и перенесите замороженный образец в криостат. Для каждого образца установите замороженный блок на зажим для образцов и нарежьте образцы толщиной 10 микрон, собрав срезы на предметных стеклах с мембранным покрытием. Дав секциям высохнуть не менее 10 минут, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы обвести ткани.

Примерно через 10 секунд поместите предметные стекла в свежеприготовленный холодный фиксирующий раствор не более чем на пять минут при температуре минус 20 градусов Цельсия. Теперь переложите предметные стекла в чистый лоток, предварительно обработанный раствором для обеззараживания поверхностной РНК. Сначала встряхните предметные стекла один раз, чтобы удалить излишки фиксатора, и промойте их шестью или восемью быстрыми погружениями в D-E-P-C-P-B-S проведите слайды.

Для удаления избытка D-E-P-C-P-B-S добавьте по 200 микролитров раствора первичного антитела в каждый участок. Через 10 минут при комнатной температуре вымойте предметные стекла, трижды окунув их в D-E-P-C-P-B-S и проведите ими один раз, чтобы удалить излишки раствора для стирки. Затем инкубируйте образцы в 200 микролитрах раствора вторичного антитела при комнатной температуре через шесть минут.

Промойте предметные стекла в D-E-P-C-P-B-S, как только что продемонстрировано, и инкубируйте их в свежеприготовленном растворе BC в течение четырех минут после еще одной быстрой промывки D-E-P-C-P-B-S смешайте 196 микролитров свежеприготовленного DAB с четырьмя микролитрами ингибитора РНК. Непосредственно перед добавлением раствора в секцию дайте DAB проявиться в течение одной-двух минут, после чего выполните промывку A-D-E-P-C-P-B-S. Затем обезвоживайте секции с помощью нескольких секунд инкубации в абсолютном этаноле и высушите стекла, чтобы перейти к LCM.

Далее по 50 мкл лизиса ввели буфер из набора для экстракции РНК в колпачок сборной трубки. Затем поместите одно предметное стекло под микроскоп стороной образца к колпачку. Выберите оптимальное увеличение для образца и отрегулируйте фокус, чтобы увидеть интересующие клетки.

Затем определите зону резки и начните резку лазером. Собрав рассеченный материал в сборную трубку, закройте собранные клетки на 30 минут при температуре 42 градуса Цельсия. В течение этого времени предварительно подготовьте колонку для очистки РНК из набора для экстракции РНК 250 микролитрами кондиционирующего буфера.

Затем загрузите 50 микролитров этанола в лизированные клетки на колонке и центрифугируйте колонку в течение двух минут при температуре 16 000 G и комнатной температуре с последующим проведением двух полосканий с промывочным буфером. Наконец, разбавьте РНК в минимальном рекомендуемом объеме 11 микролитров свободной от РНК воды, оставляя два микролитра в стороне, чтобы проверить качество РНК. Эта быстрая процедура иммуномаркировки позволяет визуализировать интересующие клетки, сохраняя при этом целостность экспериментальной РНК.

В зависимости от эксперимента, LCM может быть использована, как только что продемонстрировано, для выделения отдельных клеток или более крупных областей, представляющих интерес. Деградированная РНК оказывает значительное влияние на качество последующего анализа. Таким образом, каждый образец дополнительно обрабатывается на биоанализаторе на базе микрофлюидной платформы X, что позволяет количественно оценить и проверить целостность выделенной РНК, как показано выше.

Например, здесь типичные результаты биоанализатора как ухудшенные, так и хорошего качества. Показаны образцы РНК. Действительно, цифровые гели и электроферограммы демонстрируют важность использования ингибитора разы в каждом растворе для защиты РНК После этой процедуры высококачественная РНК может быть дополнительно обработана для последующих применений, включая секвенирование РНК MICROARRAY ИЛИ Q-R-D-P-C-R, например, на этих графиках среднее обогащение экспрессией генов TH и A A DC в микродиспарированном образце относительно средних срезов мозга было определено более чем в 170 раз.

При попытке выполнить эту процедуру, важно помнить о работе очень быстро и без материала РНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить конкретную популяцию клеток из любой ткани.