Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах с^{использованием Чик GFP нейронной} трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

Общая цель этой процедуры заключается в окрашивании и визуализации нервной корки, полученной из нервной корки, и связанной с ней сосудистой системы во время эмбрионального развития. Это достигается путем предварительного удаления нервной трубки у эмбриона дикого типа-хозяина. Эквивалентная область нервной трубки вырезается X из согласованного по стадии трансгенного куриного эмбриона GFP, ферментативно переваривается и прививается хозяину дикого типа.

В результате получается химерный эмбрион. Вторым шагом является введение флуоресцентного красителя в кровеносную систему химерных эмбрионов для визуализации развивающейся сосудистой системы. Затем эмбрионы собирают и рассекают интересующие ткани.

Наконец, образцы визуализируются с помощью конфокальной микроскопии для визуализации как меченой GFP энтеральной нервной системы, так и меченых DAI сосудистых сетей. Основные преимущества этой методики перед существующими методами, такими как классическая техника пересадки цыплят, заключаются в том, что GFP цыпленка и ткани очень яркие, а GFP цитоплазматической позволяет визуализировать клеточные проекции в нейронных сетях. Кроме того, методы маркировки GFP и DAI совместимы с визуализацией в реальном времени.

Чтобы начать подготовку рабочей зоны и всех инструментов и реагентов, необходимых для процедуры, первым шагом является создание окна в яичной скорлупе, чтобы обеспечить доступ к эмбриону. После удаления двух-трех миллилитров альбумина эмбрион должен быть виден через окно. Затем вводятся индийские чернила, чтобы помочь визуализировать эмбрион.

Для этого нужно ввести микропипетку через желточную оболочку за пределы периметра бластера. Осторожно наклоните его кончик прямо под эмбрионом. Оказавшись на месте, подайте чернила под эмбрион, подув на трубку для рта.

Следите за тем, чтобы не попасть пузырьки воздуха, которые могут привести к загрязнению. Осторожно извлеките стеклянную микропипетку. Затем с помощью изготовленного на заказ микроскальпеля, установленного на иглодержателе, сделайте очень маленький разрыв в мембране IGN рядом с областью, где будет проводиться микрохирургическое вмешательство.

Чтобы удалить интересующую область нервной трубки, с помощью микроскальпеля сделайте надрез по всей нервной трубке, начиная с одного или двух клещей и заканчивая шестью или семью. Затем разрежьте с двух сторон между нервной трубкой и сомитами, чтобы отделить нервную трубку от окружающих тканей. Будьте осторожны, чтобы не повредить сомиты.

Когда все будет готово, очень аккуратно отделите нервную трубку от нижележащего не тяжа, который должен остаться неповрежденным. Успешное иссечение нервной трубки оставит все окружающие ткани совершенно нетронутыми. Удалите и выбросьте подрезную нервную трубку.

Теперь эмбрион хозяина готов к приему донорской нервной трубки. После определения стадии, совместимого с GFP эмбриона, удалите его из яйцеклетки, сделав четыре разреза пружинными ножницами, создайте вокруг эмбриона прямоугольную форму, а затем аккуратно возьмите его с помощью дюмона. Номер пять, пинцет.

Поместите эмбрион в квадрат. Часовое стекло с согарным полимерным основанием. Осторожно встряхните эмбрион, чтобы удалить прилипший желток.

Снимите мембрану VII и прикрепите зародыш к полимерной основе с помощью мельчайших штифтов из нержавеющей стали. Затем сделайте четыре разреза прямоугольной формы вокруг нервной трубки и окружающих сомитов в той же области, которая была удалена от эмбриона-хозяина. С помощью пластиковой пересадочной пипетки переносят нервную трубку и таким образом клеща переносят ткани в стекло часов, содержащее 2% панкреатина в PBS для ферментативного пищеварения.

После 10 минут комнатной температуры с помощью нержавеющих штифтов, установленных на ручке, вручную отделите нервную трубку от всех прилегающих тканей. После выделения перенесите связанную нервную трубку на стекло другого часа на льду, чтобы смыть избыток панкреатина и остановить ферментативное пищеварение. Через пять минут рассеченная нервная трубка готова к пересадке.

Орто местно в цыпленка-хозяина. Когда вы будете готовы начать процедуру трансплантации, осторожно перенесите рассеченную нервную трубку со стекла часов на эмбрион хозяина. Расположите нервную трубку в правильной ориентации и аккуратно протолкните соседнюю эксплан в иссеченную область.

При необходимости с помощью микроскальпеля обрезайте эксплан до точного размера иссеченной области. Оказавшись в правильном положении, удалите PBS и другую жидкость, чтобы помочь донору и тканям хозяина прилипнуть и закрепить трансплантат. Успешная интеграция привитой GFP-положительной нервной трубки в курицу-хозяина дикого типа может быть оценена под флуоресцентным микроскопом.

Заклейте все окно прозрачной лентой шириной 24 миллиметра, чтобы предотвратить обезвоживание и загрязнение. Пометьте химерный эмбрион и верните яйцо в инкубатор для дальнейшего развития в желаемый момент экспериментального времени, извлеките яйцо из инкубатора и снимите прозрачную ленту, чтобы получить доступ к эмбриону. Как только это станет заметным, найдите доступную вену на желтке, убедившись, что кровоток направлен к эмбриону.

Выберите точку разветвления на одной из жилок IGN для места инъекции. С помощью пинцета удалите вити-мембрану выше выбранной точки инъекции, разрывая в противоположных направлениях. Далее отрегулируйте диаметр вытянутой стеклянной иглы по размеру жилки.

Выпейте иглу с пятью-10 микролитрами раствора Dai. Быстро введите иглу в вену и равномерно подуйте с помощью ротовой трубки, чтобы позволить dai медленно присоединиться к кровотоку, не образуя сгустка. Успех инъекции Dai можно оценить, кратко рассмотрев эмбрион под флуоресцентным микроскопом, причем эмбрион становится очевидным сразу после инъекции.

Чтобы сохранить как можно больше dii, зачерпните эмбрион на перфорированную ложку и разрежьте кровеносные сосуды и соединительные ткани, чтобы освободить эмбрион от желтка. Удалите все ослабленные оболочки и препарируйте органы, представляющие интерес. Будьте очень осторожны, чтобы не сдавливать ткань, что может привести к диффузии сухого глаза.

Немедленно зафиксируйте ткани в 4%-ном паральдегиде на один-два часа при комнатной температуре и приступайте к стандартным процедурам для исследования всего монтирования или для криосекции. Эти трехмерные реконструкции стека конфокальных изображений в области желудка показывают GFP-положительные клетки кишечного нервного гребня, окрашенную сосудистую систему и появившееся изображение обеих сетей. Репрезентативные гистологические срезы в области желудка также показывают GFP-положительные клетки кишечного нервного гребня, окрашенную сосудистую систему DII и изображение эмериджа.

Трехмерные реконструкции могут быть использованы для создания фильмов с поворотом на 360 градусов. Трехмерные реконструкции в области слепой кишки показывают положительный GFP фронт кишечного нервного гребня зеленым цветом и окрашенную красителем сосудистую систему красным цветом. На этой панели показано слияние обеих сетей.

Конфокальный стек изображений был использован для создания видеоролика о фронте миграции клеток кишечного нервного гребня и связанной с ним сосудистой сети. Этот метод позволяет нам изучать механизмы, лежащие в основе иннервации и васкуляризации органов во время развития, обеспечивая сильную флуоресцентную маркировку нейронных клеток и кровеносных сосудов. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что она требует отличной координации концов под микроскопом.

В целом, как трансплантация нервной трубки, так и инъекция красителя требуют большой практики, чтобы быть успешными.