Микрожидкостных чип для МСПМС ввода пробы

Общая цель этой процедуры заключается в получении и количественном анализе элементного состава монодисперсных микрокапель, содержащих одиночные клетки или водные растворы, с помощью I-C-P-M-S. Это достигается путем предварительного изготовления микрофлюидного чипа с использованием литья реплики с помощью PDMS. Вторым шагом является подключение шприцевых насосов к микрофлюидному чипу.

Насосы будут подавать водный образец и высоколетучую и допустимую или органическую фазу носителя PFH. При включении шприцевого насоса микрофлюидный чип потоком генерирует монодисперсные капли водного раствора образца или клеточной суспензии, фокусируясь с помощью ПФГ и выбрасывает эти капли с дополнительным ПФГ из чипа в виде струи жидкости. Заключительным этапом является вставка чипа в транспортировочный узел, состоящий из нагревателя картриджа, который испаряет капли, и мембраны де сальватора, которая удаляет растворители до ионизации и определения содержимого капель с помощью I-C-P-M-S.

В конечном итоге, записанные сигналы и калибровочное измерение с помощью стандартного раствора используются для определения элементного состава раствора образца или клеток в суспензии. Основными преимуществами нашей микрофлюидной методики перед существующими методами являются регулируемый размер капель, низкий расход образца и низкий риск нологирования при работе с клеточными суспензиями или концентрированными солевыми растворами. Кроме того, недорогой одноразовый микрофлюидный чип позволяет избежать времени очистки и предотвращает перекрестное загрязнение.

Демонстрировать процедуру будут все vin sc, аспирант из лаборатории профессора GTA и Паскаль Фабрика, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать процесс МИКРОПРОИЗВОДСТВА, отмерьте 40 граммов PDMS и четыре грамма отвердителя PDMS в большой пластиковой чашке. Равномерно перемешайте обе части лопаткой и поместите чашку в вакуумную сушку на 20-30 минут, чтобы дегазировать все пузырьки из смеси.

Во время дегазации. Поместите литейную форму на микроструктурированную кремниевую пластину и используйте направляющую структуру вокруг конструкции, чтобы закрепить ее на плоской кремниевой пластине. Сверху свободно поставьте еще одну форму для литья.

Залейте примерно три-четыре грамма смеси Degas PDMS на обе формы для литья. Переложите обе кремниевые пластины на горячую пластину. Высушите PDMS при температуре 150 градусов Цельсия в течение шести минут, а затем остудите.

Затвердевают конструкции PDMS на стенде при комнатной температуре с помощью металлического шпателя. Аккуратно отделите цельные блоки PDMS от форм. Защитите склеивающие поверхности обоих блоков от загрязнения частицами и отпечатками пальцев.

С помощью слоя прозрачного скотча детали PDMS теперь можно обрабатывать и обрезать по размеру с помощью ножниц. После обрезки снимите ленту с микроструктурированного блока PDMS и используйте дырокол для биопсии для создания микрофлюидных входных портов. На этом процесс изготовления микроструктурированной половины устройства завершен, и теперь она готова к соединению и сборке со своим плоским аналогом.

Чтобы подготовить услуги по склеиванию PDMS с PDMS, начните с нанесения слоя отвердителя PDMS на чистую кремниевую пластину со скоростью 6 000 об/мин в течение 30 секунд, пока отвердитель еще влажный, приведите интерфейс склеивания микроструктурированного блока PDMS в контакт с пластиной и осторожно надавите на верхнюю часть PDMS, чтобы сформировать бесшовное уплотнение без пузырей. На отдельном этапе снимите защитную ленту с плоского аналога. Затем медленно отделите микроструктурированный PDMS от кремниевой пластины.

Тщательно выровняйте две части PDMS и соедините два соединительных интерфейса. Аккуратно сожмите два блока, чтобы удалить любые межфазные пузыри и отверждите собранный чип PDMS в течение 24 часов При комнатной температуре с помощью канцелярского ножа и юстировочного устройства сделайте надрез вдоль индикаторной линии, ортогонально выходному соплу. Осмотрите чип под микроскопом на предмет обрезки дефектов и загрязнения частицами рядом с открытым выходным соплом.

После оценки качества изготовления внутренние поверхности микроканала PDMS готовы к разрознению. В химической колпаке подключите один конец бутылки «волк» к источнику сухого азота, а другой конец бутылки подсоедините к входным отверстиям чипа PDMS. С помощью нескольких пробирок, подключенных к центральному коллектору, затем наберите пипеткой 50 микролитров селина в бутылку «Волк» и закройте верхнюю крышку.

Включите несущий поток азота и промойте микроканалы солевым раствором, содержащим пар, в течение 20 минут со скоростью потока примерно один миллилитр в секунду. Наконец, отсоедините входные трубки от бутылки «Волк». Чипы PDMS с покрытием готовы к проведению масс-спектрометрических экспериментов по масс-спектрометрическим измерениям отдельных клеток.

Во-первых, разбавьте входной образец подходящим буфером таким образом, чтобы эффективная клеточная концентрация составляла менее 10 миллионов клеток на миллилитр. При подготовке к масс-спектрометрии начните с присоединения трубок к шприцам для образцов. Зарядите два пятимиллилитровых шприца с ПФХ и загрузите входной образец в отдельный одномиллилитровый шприц. Удалите все пузырьки, застрявшие внутри шприцев и трубки, и загрузите два шприца в шприцевой насос.

Убедитесь, что транспортировочная трубка правильно выровнена и все газовые трубки подключены. Затем подсоедините трубки шприца к входным портам чипа PDMS и активируйте шприцевой насос на три-пять минут. Во время этого процесса стабилизации потока удалите лишнюю жидкость из выпускного отверстия с помощью салфетки.

Если жидкость выходит, то струя не образует прямую струю. Через пять минут постарайтесь стереть все потенциальные препятствия на выходе чипа чистой салфеткой. Если это не удалось, выбросьте существующую микросхему и замените соединение на новую микросхему.

Снимите заглушку с адаптера циклонного распылителя и осторожно вставьте в адаптер стабилизированную потоком микросхему PDMS. Измените расход в соответствии с рекомендуемыми настройками и снова стабилизируйте поток на две-пять минут. Одновременно регулируйте расход для всех газов до тех пор, пока не будет достигнута максимальная интенсивность сигнала исследуемого аналита.

Кроме того, настройте мощность плазмы и напряжение фокусирующей линзы на масс-спектрометре для дальнейшего повышения интенсивности сигнала при оптимизации сигнала. Установите масс-спектрометр на время задержки 10 миллисекунд и начните сбор данных. После измерений перенесите необработанные данные в программу анализа данных.

В типичной процедуре анализа данных все измерения сначала разделяются на ячейки данных, где каждая ячейка представляет количество отсчетов за 10 миллисекунд времени задержки, затем для всех ячеек генерируется гистограмма, которая подгоняется с помощью функции распределения Гаусса. Среднее значение и разброс отдельных подгонок представляют собой как среднюю интенсивность сигнала, так и стандартное отклонение при определенном соотношении массы к заряду. Чтобы начать процесс калибровки, сначала измерьте стандартный раствор с той же скоростью потока, что и образец.

Используя чип PDMS для генерации капель, настройте два пятимиллилитровых шприца для ПФГ и один одномиллилитровый шприц для стандартного раствора. Затем, используя чашку Петри в качестве держателя для образца микроскопа, поместите чип PDMS в чашку Петри и сфокусируйте чип при малом увеличении, повторяя предыдущие шаги протокола. Стабилизируйте образование капель в микроканале PDMS в течение трех-пяти минут с помощью высокоскоростной камеры.

Начните запись изображений водной капли на чипе на вторичном переходе, чтобы получить средний диаметр капли по записям. Используйте программное обеспечение для анализа изображений со специальным пакетом для морфации капель, оптометрии и велосимметрии. Предполагая, что каждая капля может быть смоделирована как сферический объект, средний объем капли может быть оценен с использованием среднего диаметра капли, полученного программным обеспечением.

Затем разделите известную концентрацию аналита в образце на средний объем капли, чтобы получить массу аналита, содержащегося в одной капле. Затем переведите полученную массу в число атомов. Наконец, рассчитайте общую эффективность обнаружения, разделив количество измеренных ионов в капле на предыдущий результат.

Эта эффективность обнаружения теперь может быть использована в качестве калибровочной величины для определения количества атомов в неизвестном образце. Используя микрофлюидный генератор капель, отдельные клетки могут быть инкапсулированы в монодисперсные водные капли со средним диаметром менее 50 микрон и проанализированы с помощью I-C-P-M-S. Органическая оболочка ПФГ, окружающая водную каплю, может быть легко удалена до того, как образец достигнет детектора I-C-P-M-S.

При измерении растворов высокая монодисперсия капель может наблюдаться как низкая дисперсия между группами сигналов, поступающих от одного, двойного или тройного подсчета капель в течение заданного времени задержки. После надлежащей калибровки можно определить содержание железа в ансамбле отдельных эритроцитов крупного рогатого скота, каждая из которых суспендирована в отдельных каплях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить и использовать эти микрофлюидные чипы для количественного элементного анализа очень малых объемов образцов или отдельных частиц и клеток.

Изготовление этих чипов занимает менее 15 минут, при правильном выполнении каждого чипа требуется время. Кроме того, легко модифицируемые чипы позволяют интегрировать дополнительные микрофлюидные модули для усовершенствованной предварительной обработки образцов и одновременного внедрения образцов и стандартов для повышения эффективности и производительности образцов.