Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Общая цель этой процедуры заключается в получении стабильно трансдуцированных органоидов из первичного кишечного эпителия мыши для последующего анализа кишечных органоидов. Это достигается путем первого пересечения HEC 2 93 Т-клеток лентивирусными упаковочными векторами и лентивирусной плазмидой, кодирующей интересующий ген для производства лентивирусных частиц с высоким титром. Вторым этапом является предварительная обработка культивируемых кишечных органоидов мышей рядом факторов роста для получения кистозных гиперпролиферативных крипт.

Затем трансдуцируйте органоиды с лентивирусом с высоким титром и инкубируйте трансдуцированные органоиды в матригеле. Последним шагом является встраивание полноценных трансдуцированных органоидов в парафин для последующего иммуногистохимического анализа. В конечном счете, лентивирусная трансдукция органоидов используется для создания генетических изменений в модели кишечного эпителия in vitro, которая является надежной, воспроизводимой и быстрой.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как линии раковых клеток, заключается в том, что органоиды представляют собой немутировавшую смещенную иерархию стволовых клеток. При поляризации текстовых клеток он может дифференцироваться во все различные типы клеток эпителия тонкого кишечника. Кроме того, трансдуцированные органоиды могут быть использованы для изучения конкретных генетических элементов, тем самым перевешивая использование трансгенных мышей и грани стоимости и скорости.

Производство лентивирусных частиц представляет собой пятидневный протокол, который начинается с расщепления HEC 2 93 Т-клеток до 60-80% беглости в колбе площадью 162 квадратных сантиметра в среде для клеточных культур. Инкубируйте клетки в течение ночи в увлажненном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день. Приготовьте раствор для трансфекции ДНК и раствор для трансфекции полиэтиленамином или PEI, как описано в тексте протокола.

Добавьте раствор для трансфекции ДНК в вихрь раствора PEI или переверните несколько раз и инкубируйте в течение пяти минут. При комнатной температуре. Капните два миллилитра раствора DNA TRANSFECTION plus PEI на Т-клетки HEC 2 93 и инкубируйте в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия через четыре часа.

Обновите питательную среду. Чтобы удалить ПЭИ, инкубируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия, на четвертый день соберите надосадочную жидкость в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте в клетки новую питательную среду и верните колбу в инкубатор, центрифугируйте собранную надосадочную жидкость при 500 Gs в течение пяти минут.

Чтобы удалить омертвевшие клетки, затем с помощью большого шприца объемом 60 миллилитров протолкните SUPERNAT через фильтр 0,45 микрометра. На следующий день храните отфильтрованный супернат на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Соберите центрифугу и отфильтруйте вторую партию надосадочной жидкости, как показано для первой партии.

Объедините две партии надосадочной жидкости в ультрацентрифужных пробирках. Центрифугируйте при давлении 50 000 GS в течение 90 минут. Когда центрифугирование будет завершено, очень осторожно извлеките капсулы, содержащие пробирки ультрацентрифуги, и поместите их в колпак с ламинарным потоком.

Откройте капсулу, удерживающую ультрацентрифужную пробирку, и осторожно сцедите среду вместе с гранулой на верхней стороне пробирки. Важно помнить, с какой стороны пробирки должна была сформироваться апелляция, так как вирусные гранулы может быть трудно визуализировать. Затем с помощью микропипетки удалите последний кусочек среды, стараясь при этом не перемешать непрозрачную коричневую гранулу, которая видна на боковой стороне дна ультрацентрифужной пробирки.

Повторно суспендируйте эту гранулу в 500 микролитрах органоидной питательной среды с добавлением ингибиторов никотинамидкиназы и поли ресуспензии мозга. Суспензия в этой среде важна, так как вирус с высоким титром будет использоваться непосредственно для трансдукции органоидов за два дня до трансдукции. Разделите полную лунку органоидов площадью 0,95 квадратного сантиметра в новую лунку 48-луночной пластины.

Следуя ранее опубликованному протоколу. Цель состоит в том, чтобы получить около 50 малых органоидов в органоидной культуре. Среда дополнена ингибитором гликогенсинтазыкиназы и никотинамидом.

Для получения кистозных гиперпролиферативных крипт. Инкубируйте органоиды в течение двух дней в день трансдукции, соберите органоиды с помощью микропипетки P 1000. Пипеткой нанесите матру гелем и средами вверх и вниз, тем самым нарушая смесь.

Поместите смесь в тубу объемом 15 миллилитров. Разрушьте смесь с помощью пипетки PEs, в которой дистальное отверстие было уменьшено путем расплавления органических компонентов путем центрифугирования при 100 G в течение пяти минут. Затем достаньте надосадочную жидкость по 500 микролитров предварительно подогрейте один х трипсин и повторно суспендируйте органоиды в течение трех минут.

На водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия инактивируйте трипсин, добавив 3,5 миллилитра среды для культивирования клеточной линии в центрифуге в течение пяти минут. При 500 Г. Снимите супер натан, оставьте гранулу примерно в 20 микролитрах среды. Перелейте органоиды в этом последнем небольшом количестве среды в лунку.

На 48 луночной пластине. Добавьте к органоидам заранее приготовленный лентивирус с высоким титром в трансдукционной среде и повторите. Инкубируйте смесь органоидных вирусов в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для культур, чтобы обеспечить трансдукцию через один час, добавьте один миллилитр органоидной культуры в среду для органоидных вирусов, поддержите и перенесите смесь в микроцентрифужную центрифугу в пробирке при давлении 850 GS на пять минут.

Чтобы гранулировать органоиды, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу. В 20 микролитров ледяного геля матра положите каплю в середину лунки. В 48-луночной тарелке и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Чтобы капля застыла через 15 минут. Осторожно добавьте 250 микролитров органоидной культуры. Среда дополнена ингибиторами никотинамида и киназы.

Разогрейте алюминиевый блок в инкубаторе при температуре 70 градусов Цельсия, чтобы парафин оставался жидким. Удалите среду из одной лунки с полностью выращенными органоидами, оставив внедренные органоиды нетронутыми, и добавьте один миллилитр 4%-ного параформного альдегида PBS непосредственно в лунку. Замените параформный альдегид на один миллилитр PBS.

Восстановите неподвижные органоиды в PBS и переложите в стеклянный флакон. Дайте органоидам опуститься на дно в течение одной минуты. Далее отсоедините пипеткой PBS и замените его на 70% этанол, в котором растворена пара капель раствора эоина.

Чтобы обеспечить визуализацию органоидов на протяжении всего процесса внедрения, оставьте органоиды в 70% этаноле при комнатной температуре на 30 минут. Удалите 70% этанол с помощью осторожного пипетирования. Органоиды можно визуализировать на глаз из-за розоватого цвета эоина.

Замените раствор для заделки 96% этанолом и оставьте таким образом при комнатной температуре на 30 минут. Затем пропустите органоиды через 70% этанола, 90% этанола, 96% этанола, 100% этанола, 100% этанола, ксилола и ксилола. Сцедите последний ксилол, промойте и налейте в стеклянный флакон парафин.

Поместите флакон сразу в разогретый алюминиевый блок при температуре 70 градусов Цельсия на 30 минут. Через 30 минут замените парафин на новый чистый парафин с помощью подогрева, полиэтилена или пипетки. Слейте парафин и с помощью предварительно подогретой дозатора или пипетки с большим отверстием заправьте органоиды в форму парафинового блока в слой жидкого парафина.

Нагрейте иглу для пресечения горелкой Бунзена и манипулируйте всеми органоидами как можно больше по направлению к центру формы парафинового блока. Когда локализация органоидов в форме удовлетворительна, слегка охладите форму, чтобы парафиновый слой затвердел. Завершите блок, налив сверху еще парафина, и добавьте стандартную гистологическую закладную кассету.

В этом протоколе органоиды кишечного эпителия трансдуцировались лентивирусами. Нормальные органоиды растут как крипты К, ворсинчатые структуры с рядом крипт, которые выходят из общего ворсинчатого домена. При обработке этих органоидов ингибитором GSK 3B (CHIR 9 9 0 21) пролиферация увеличивается, и крипты становятся кистозными после трансдукции органоидов.

Используя сверхэкспрессию лентивирусного EGFP, органоиды экспрессируют флуоресцентные этапы усиления трансдукции EGFP, которые могут быть выполнены при низкой эффективности трансдукции, такие как инокуляция или длительная инкубация вируса не требуются, поскольку эти этапы не увеличат и без того высокую эффективность. Впоследствии эти органоиды обрабатываются для РНК-методов и иммуногистохимии. Это репрезентативное изображение представляет собой срез кишечного органоида мыши, окрашенный на BRDU после инкубации с BRDU в течение одного часа до фиксации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансдуцировать органоиды из первичного эпителия кишечника с помощью чечевичных или ретровирусных частиц.