Использование флуоресцентной активированной сортировки клеток для изучения тип-специфической для клеток экспрессии генов в тканях мозга крыс

Общая цель этой процедуры заключается в выделении отдельных типов нервных клеток из ткани мозга для последующего анализа. Это достигается путем первичной диссоциации нервной ткани в одноклеточную суспензию. На втором этапе миелин удаляется из суспензии, а затем клетки окрашиваются на антитела, специфичные для клеточного типа.

На заключительном этапе отдельные клеточные популяции сортируются с помощью проточной цитометрии. В конечном счете, этот метод выделения специфического типа клеток позволит пользователям анализировать изменения в экспрессии генов или белков или эпигенетические модификации специфическим для типа клеток способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как какие типы клеток экспрессируют определенные рецепторы, какие экспрессируют определенные белки, а какие экспрессируют определенные эпигенетические модификации, чтобы мы могли лучше понять специфические для типов клеток механизмы в мозге.

Начните нейронную диссоциацию с помощью стерильных бритвенных лезвий, чтобы нарезать каждый образец, собранный из тканей мозга взрослого человека, небольшими кусочками по 30-400 мг на крышке планшета для культивирования с шестью лунками. Затем погрузите ткань в один миллилитр HBSS, не содержащего кальция и магния, и с помощью пипетки перенесите образцы в стерильные двухмиллилитровые центрифужные пробирки, когда все ткани будут собраны. Центрифугируйте образцы и аспирируйте надосадочную жидкость.

Добавьте 1 900 микролитров теплого фермента. Смешайте один и инкубируйте образцы в течение 15 минут. В водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия переворачивайте трубку несколько раз каждые пять минут, чтобы снова суспендировать осевшие кусочки ткани.

В конце инкубации добавьте 30 микролитров свежеприготовленного фермента. Смешайте по два с каждым образцом и аккуратно переверните пробирки. Затем с помощью пипетки для обнаружения вредителей с меткой «один» диссоциируйте каждый образец с помощью 30 итераций вверх и вниз.

Следите за тем, чтобы не образовывались пузыри. Инкубируйте образцы еще 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия с инверсией каждые пять минут, с последующей диссоциацией образцов пипеткой для выявления вредителей. Номер два, как только что было продемонстрировано.

Затем переключитесь на пипетку No три, повторите диссоциацию и инкубируйте образцы еще 10 минут. На водяной бане с инверсией каждые пять минут по окончании инкубации фильтруют одиночные клеточные суспензии через 80 микронные клеточные сетчатые фильтры в 15-миллилитровые пробирки Falcon. Промойте каждое ситечко 10 миллилитрами HBSS без кальция и магния, чтобы остановить ферментативные реакции, когда последний образец будет отфильтрован, открутите пробирки вниз и аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы истощить миелин из клетки.

Суспензии тщательно ресуспендируют гранулы в 400 микролитрах буфера для удаления миелина, и добавляют соответствующее количество шариков для удаления миелина в каждую пробирку. Пипеткой подавайте растворы вверх и вниз до тех пор, пока ячейки и шарики полностью не перемешаются. Затем инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут.

После инкубации промойте каждый образец в пяти миллилитрах буфера для удаления миелина, пока клетки вращаются, поместите одну колонку для каждого образца в магнитное поле магнитного сортировщика и поместите чистый фильтр 80 микрон поверх каждой колонки. Промойте каждый фильтр и колонку одним миллилитром буфера для удаления миелина, трижды собрав весь поток в контейнер для отходов. После окончательного промывки поместите пять полистироловых трубок с круглым дном непосредственно под каждую колонку, чтобы собрать элюат.

Затем аспирируйте названный супер из образцов и ресуспендируйте гранулы в 500 микролитрах буфера для удаления миелина. Сразу же нанесите клеточные суспензии на колонки, собрав клетки в расположенные ниже пробирки. Затем промыть каждый фильтр и колонку четыре раза одним миллилитром миелина для удаления, буфером на одну промывку.

После последней промывки раскрутите клетки вниз и аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы окрашивать клетки для сортировки методом проточной цитометрии. Окуните каждый образец в вихрь в течение примерно двух секунд, чтобы диссоциировать гранулы и перенести один микролитр клеток из каждой пробирки в отдельные пробирки. Для контроля окрашивания немедленно добавьте пять микролитров блока FC в каждую трубку, включая контрольные элементы окрашивания.

Затем снова сделайте образцы вихревыми и инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия. Через пять минут добавьте 100 микролитров соответствующего первичного коктейля антител. Закройте пробирки, чтобы защитить антитела от света, и инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

В конце инкубации промойте образцы в двух миллилитрах промывочного буфера, затем отасканируйте надосадочную жидкость и пометьте каждый образец 100 микролитрами соответствующего вторичного антитела. Накройте трубки крышками и поместите их при температуре четыре градуса Цельсия на 15 минут. Затем промойте образцы в двух миллилитрах промывочного буфера, центрифугируйте образцы, а затем отсадите.

Надосадочная жидкость Resus, суспендировать гранулы в 250 микролитрах стерильного PBS и отсортировать клетки здесь репрезентативным потоком отсортированных популяций нервных клеток из одного мужского гиппокампа показано, что клетки были забиты в первую очередь от всех возможных событий на основе их свойств прямого и бокового рассеяния. Затем одиночные клетки или синглеты были отделены от любых дублетов или более крупных скоплений клеток в зависимости от их размера, чтобы обеспечить точную сортировку отдельных типов клеток, затем одиночные клетки были отсортированы на популяции CD 11, B-положительных и CD-11 B-отрицательных клеток с дальнейшей сортировкой CD 11 B-отрицательных клеток на GT 1 и TH 1 положительные клетки. Затем программа анализа была использована для определения общего числа событий в каждой популяции, а также процентного соотношения родительских популяций для подтверждения чистоты отсортированных клеток.

В этом конкретном примере относительная экспрессия генов альтернативного типа клеток была проанализирована с помощью ПЦР в реальном времени. Как и ожидалось, эти данные подтвердили чистоту отсортированных клеток, а также выявили некоторые интересные различия между исследуемыми областями мозга. После подтверждения чистоты сорта, экспрессия других генов, представляющих интерес, может быть измерена для определения конкретного типа клеток, в которых они экспрессируются, или же их экспрессия изменяется после обработки специфическим для определенного типа клеток образом.

Например, здесь была исследована экспрессия связывания коров, кальций-связывающего белка, часто используемого для идентификации нейронов в гиппокампе и мозжечке. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как изолировать определенные типы нейронных клеток, представляющих интерес, такие как показанная здесь нервная клетка, используя соответствующие антитела на клеточной поверхности.