Эффективная генерация специфических для нокина репортеров hiPSC Neural Lineage с использованием системы CRISPR/Cas9 и Cas9 Double Nickase

Общая цель этой процедуры заключается в создании специфических для линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или репортеров H-I-P-S-C с использованием CRISPR Cas девяти опосредованной гомологичной рекомбинации. Это достигается путем предварительного проектирования и конструирования векторов наведения. Вторым шагом является проектирование и конструирование одиночных направляющих РНК для системы CRISPR Cas nine или системы CAS nine N double Nick case.

2 93 ФУТА. Затем клетки трансфицируют с помощью одиночных направляющих РНК и вектора экспрессии CAS nine, а ДНК извлекают и амплифицируют для оценки с помощью анализа T seven ENDONUCLEASE one. Заключительным этапом является выполнение in silico прогнозирования потенциальных нецелевых участков. Сайтов. В конечном счете, HI-ПСК будут трансфицированы вектором нацеливания и девятью компонентами системы CRISPR Cas, чтобы заставить нейронную линию сбивать репортерные клеточные линии.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в традиционной гомологичной рекомбинации. Вместо этого, CRISPR cast nine Mediated Gene Targeting имеет гораздо более высокую эффективность нацеливания. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что для создания одиночной ГА РНК может потребоваться некоторая практика.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги для проектирования RA с одним руководством и для прогнозирования нецелевых сайтов трудно изучить, поскольку концепция CRISPR Cas nine была представлена только недавно для редактирования генов, и новые онлайн-инструменты используются при определении маркера, специфичного для линии. Найдите геномную последовательность гена и спроектируйте соответственно плечи гомологии. В этом примере используется геномный локус A LDH one L one.

Конструкт нацеливания создается путем субклонирования GFP ниже геномной последовательности непосредственно перед тем, как стоп-код на соединенных путем саморасщепления двух последовательностях А-пептида добавляет кассету с положительным отбором, такую как кассета с флюсированным неомицином F, после репортера включает кассету с отрицательным выбором, например, тимидинкиназу за пределами плеча трех простых гомологий. Начните эту процедуру с определения маркера, специфичного для линии, который будет нацелен на то, чтобы сделать репортера LDH одним L, используемым в этой демонстрации. Скопируйте последовательность CDNA из базы данных NCBI.

Перейдите к поиску человека блатта, чтобы получить выравнивание геномной ДНК. Перейдите на вкладку браузера, чтобы просмотреть сборку гена на вкладке просмотра. Нажмите «ДНК», чтобы получить полную последовательность геномной ДНК в быстром формате.

Найдите стоп-код на последовательности ДНК, где будет помечена двусторонняя последовательность и репортерная кассета. Найдите протоспейсер, соседний мотив или Пэм, например, NGG, в непосредственной близости от стоп-кода на сканировании обеих нитей, чтобы найти подходящую последовательность NGG. Скопируйте последовательность 20 базиса непосредственно перед NGG и вставьте ее в веб-инструмент проектирования Z подогните олигопласты дизайна с вылетами, совместимыми с MLM 3 6 3 6.

Вектор экспрессии GRNA человека с промотором U six. После того, как оба олигопласта были синтезированы, приступайте к созданию двухцепочечной одиночной направляющей РНК для реакции объемом 50 микролитров. Добавьте 22,5 микролитра прямого и обратного олигопласта соответственно и пять микролитров буфера Анны на колене, денатурируйте оба олигопласта при температуре 70 градусов Цельсия в течение 15 минут и постепенно охладите до комнатной температуры.

Затем смешайте и переложите олигону с BSMB один переваренный MLM 3 6 3 6. Для реакции объемом 20 микролитров добавьте один микролитр олиго, 100 нанограмм MLM 3, 6, 3, 6 и один микролитр Т-4-лигазы, инкубируйте при комнатной температуре в течение ночи на следующий день, преобразуйте клетки DH из пяти альфа-компонентов с продуктом лигирования путем теплового шока при 42 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Выращивайте бактерии на пластине с ампициллином LB при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день выберите от трех до пяти колоний для подготовки плазмид. Впоследствии плазмидная ДНК подтверждается коммерческим секвенированием и правильная плазмида подготавливается с использованием стандартного протокола maxi prep для начала этой процедуры, получения случая двойного ника CAS nine ND 10 вектора Разработка пары прямых и обратных олигон для каждого локуса нацеливания в соответствии с той же процедурой, которая продемонстрирована для системы CRISPR Cas nine. LDH one L one снова будет здесь примером.

Скопируйте последовательность из 20 оснований непосредственно перед NGG и вставьте ее в паутину. Проектирование инструмента Z подходит для получения олигон с более чем мэнком, совместимым с вектором. Удалите первое и последнее основания прямых и обратных олигон, которые отображаются с помощью инструмента проектирования Z fit.

Синтезируем прямые и обратные олигопласты и назовем их следующим образом. Строчные FN прописные F и строчные FN прописные R Для PAM с одной стороны от целевого сайта и строчные R и прописные F и строчные R и прописные R для PAM с другой стороны от целевого сайта этих N - это число для обозначения различных PAM, строчные f и r представляют расположение PAM либо на смысловой или антисмысловой цепи, а прописные f и r представляют прямые и обратные олиго. После определения оптимизированной пары одиночных направляющих РНК, которые будут использоваться для CAS 9n с помощью анализа T 7 E one, приступают к получению двухцепочечной одиночной направляющей РНК для реакции объемом 50 микролитров, добавляют 22,5 микролитра прямого и обратного олигопластов соответственно и пять микролитров буфера для коленопреклонения.

Денатурируйте оба олигопласта при температуре 70 градусов Цельсия в течение 15 минут и постепенно охлаждайте до комнатной температуры. Смешайте и переложите олигос с bbbs. Один переваренный двойной нос CAS девять ND 10 а вектор.

Для реакции объемом 20 микролитров добавьте один микролитр одиночной направляющей РНК, 100 нанограммов bbbs, один переваренный вектор и один микролитр Т-четырех лигаз, инкубируйте при комнатной температуре в течение ночи пять альфа-составляющих клеток DH с продуктом лигирования путем теплового шока при 42 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Вырастите бактерии в lb агаре ампициллине при температуре 37 градусов Цельсия за ночь. На следующий день выберите от трех до пяти колоний для подготовки плазмид.

Впоследствии плазмидная ДНК подтверждается коммерческим поставщиком услуг секвенирования, и правильная плазмида подготавливается с использованием стандартного протокола maxi prep для начала этого анализа. Совместно трансфицировать 2 93 фут-клетки с плазмидой одной направляющей РНК и вектором экспрессии CAS девять в 0,5 мкг вектора одной направляющей РНК, 0,5 мкг вектора экспрессии CAS nine и 1,5 мкг липэктомии 2000 года. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов.

Через 72 часа соберите клетки, удалив питательную среду из каждой лунки. Добавление 100 микролитров ДНК для быстрой экстракции буфера и рейтинга Триера энергично переносит клетки в пробирки. Инкубируйте смесь при температуре 68 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем при температуре 95 градусов Цельсия в течение восьми минут.

Это шаблон для последующих ПЦР-экспериментов. Настройте ПЦР для амплификации последовательности, фланкирующей прилегающий мотив протоспейсера. Для реакции объемом 50 микролитров соедините один микролитр шаблона, 0,5 микролитра Геркулеса, два 0,5 микролитра ДМСО 10 микролитров пяти х буфера, 0,5 микролитра смеси A-D-N-T-P и один микролитр прямой и обратной смеси грунтовки.

Проводите ПЦР в соответствии с параметрами, описанными в протоколе, когда ПЦР завершена и концентрации ДНК продуктов ПЦР были измерены при 400 нанограммах продуктов ПЦР на два микролитра буфера для пищеварения, добавьте DD H2O в конечную реакцию. Объем 19 микролитров выдерживаем в кипящей воде в течение пяти минут. Дайте реакции постоять на столе от 45 до 60 минут, чтобы она естественным образом охладилась до комнатной температуры.

Далее добавьте один микролитр T seven E one и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Остановите реакцию, добавив два микролитра 0,25 моляра ЭДТА, смешанного с шестью красителями, загружающими XДНК. Загрузите все 20 микролитров реакции в 2,5% гель AROS.

Запустите гель при напряжении от 100 до 150 вольт в течение 30 минут. Осмотрите гель под воздействием ультрафиолетового излучения, чтобы оценить опосредованное расщеплением одной направляющей РНК. Последующее создание репортеров нейролиний с помощью электроиндуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или HI-ПСК с линеаризованным вектором-мишенью CAS 9 0 0 3 экспрессионного вектора и подходящим вектором или векторами одиночной направляющей РНК Потенциальные нецелевые сайты могут быть предсказаны с помощью онлайн-инструмента с открытым исходным кодом под названием CS ot, который представляет собой программу, основанную на жемчуге.

Для оконной системы загрузите программу CS OT и файлы базы данных генома человека на локальный жесткий диск. Подготовьте целевой файл спроектированной одиночной направляющей РНК в формате FASTA. Откройте файл с именем cas ot.

Появится командное окно. Пока оставим все как есть. Далее откройте файл с именем opt generator.

Чтобы сгенерировать строку опции, вставьте путь и имя целевого файла в диалоговое окно опции минус T или минус цель. Вставьте путь к файлу последовательности генома в диалоговое окно опции «минус G» или «минус геном». Скопируйте строку параметров и вставьте ее в командное окно CAS OT.

Показано ранее по завершению работы программы cas OT, запущенная папка будет сгенерирована. Откройте файл CSV в папке с помощью программы для работы с электронными таблицами. Этот файл содержит следующую информацию для каждого нецелевого сайта, хромосомного и геномного местоположения.

Последовательность несогласованного типа сайта, общее количество несовпадающих оснований и информация об экзонах, относящаяся к нецелевому сайту до трансекции. HI PSC. Одиночные направляющие РНК оцениваются в клетках размером 2 93 фута с помощью анализа T seven E one.

В этом репрезентативном результате одиночные направляющие РНК предназначены для нацеливания на оли человека. Две линии генов с первой по третью трансфицируются вектором экспрессии CAS 9, а линии с четвертой по 11 трансфицируются вектором экспрессии CAS nine Nnase. В качестве контроля используется GFP.

Вторая дорожка содержит одну направляющую РНК для оли. Двойное нацеливание с использованием CAS девятая полоса пять содержит только связывающую цепь. Шестая дорожка содержит только одну направляющую РНК-связывающую антисмысловую цепь, а девятая и 10-я дорожки содержат пару одиночных направляющих РНК для обеих цепей ДНК.

Непереваренный продукт ПЦР состоит примерно из 614 пар оснований Во второй дорожке. Часть продуктов ПЦР расщепляется в две полосы, состоящие примерно из 470 пар оснований и 140 пар оснований с процентом вставки и удаления 33% в девятой и 10-й полосах. Две расщепленные полосы представляют собой около 410 пар оснований и 200 пар оснований с процентом вставки и удаления от 3 до 8%. После освоения вектора и только одного направляющего дизайн и оценка могут быть выполнены примерно за неделю.

Она выполняется правильно после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток с широким спектром функций генов в развитии и болезнях в системах человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проектировать и конструировать одиночные направляющие массивы для систем CRISPR Cas nine и CAS nine N double N.