Время дифференциальной окраски Техника сочетании с полноценного двустороннего Gill денервации для изучения Ionocytes в Рыбок

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании пролиферации брахиальных цитов в жабрах золотых рыбок, лишенных внешней иннервации. Это достигается путем помещения рыб в ванну со специфическим красителем для окрашивания ранее существовавших митохондрий, богатых плечевыми цитами. Вторым этапом является выполнение полной двусторонней денервации жабр.

Далее рыб усыпляют. Жабры собирают. Циты помечаются с помощью антитела против натрия и калия при ТФК.

Затем последним шагом является визуализация и подсчет ранее существовавших и вновь дифференцированных цитов. В конечном счете, на этот раз используется метод дифференциального окрашивания с двусторонней гильдейской денервацией, чтобы показать пролиферацию и распределение жаберных цитов у золотых рыбок без какого-либо нервного вмешательства со стороны центральной нервной системы. Таким образом, основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для понимания динамического поглощения ионов и изучения перераспределения цитов в эпителии желудочно-кишечного тракта рыб.

Сначала приготовьте один миллимолярный митральный трекер красного стока, растворив 50 мкг в 94 микролитрах диметилсульфоксида, и беречь от света. Далее подготовьте от трех до шести темных коробок с максимальным объемом 600 миллилитров. Наполните каждый ящик 400 миллилитрами воды и поместите в каждый камень, чтобы обеспечить источник кислорода.

Поместите в коробки золотых рыбок весом от 30 до 40 грамм. Через 30 минут добавьте раствор трекера Mitre до полной концентрации 0,1 микромолярного красителя и 0,01% ДМСО. Купайте рыбу в течение четырех часов.

Через четыре часа включите подачу воды в коробки и дайте красителю вымыться. Если это контрольные животные, восстановите рыб в течение трех-пяти дней, затем приступайте к иммуногистохимии, в противном случае приступайте к процедуре полной двусторонней денервации. Во-первых, обезболите рыбу, поместив ее в газированную бензокаиновую водяную баню.

Как только дыхание прекратится, поместите рыбу на операционный стол и вставьте трубку в щечную полость. Чтобы орошать жабры газированным раствором анестетика, расположите рыбу так, чтобы голова была слегка наклонена вниз, чтобы обеспечить лучший доступ к области за четвертой жаберной дугой. Аккуратно поднимите оперкулом с помощью прямых щипцов стандартного образца, А затем поместите тканевые ретракторы между оперкуломом и внутренней частью головы. Осторожно откройте тканевые ретракторы, чтобы оперкулом не прилегал к голове, а жабры оставались открытыми.

Положите ручки ретрактора рядом с головой, чтобы обеспечить доступ ко всем четырем жаберным дугам. Убедитесь, что обезболивающим раствором проводится орошение жабр и поместите изогнутые или прямые щипцы стандартного образца между четвертой жаберной дугой и затылком. Аккуратно раскройте щипцы, чтобы создать напряжение в связке.

Прикрепление четвертой жаберной дуги к головке парой щипцов номер пять. Создайте отверстие в два-три миллиметра, проколов эпителий, соединив дорсальный конец жаберных дуг с ушной полостью. Будьте осторожны и не погружайтесь слишком глубоко, так как существует риск повредить крупный кровеносный сосуд.

Далее возьмите маленькую ватную палочку с щипцами номер пять, и с ее помощью осторожно разверните разрез, чтобы обнажить девятый и 10-й нервы. Освободите нервы от любой соединительной ткани с помощью щипцов номер пять. Опять же, следите за тем, чтобы не повредить кровеносные сосуды.

После того, как нервы будут обнажены и идентифицированы, используйте изогнутые пружинные ножницы, чтобы аккуратно разрезать нервы, удерживая разрез. Откройте с помощью прямых щипцов стандартной формы. После перерезания нервов аккуратно втяните изогнутые щипцы и удалите ткань.

Ретракторные швы не требуются, потому что разрез должен закрыться сам по себе в течение 24-48 часов. Повторив процедуру с другой стороны головы, переключите орошение жабр с обезболивающей на свежую газированную воду и дайте рыбке восстановиться от наркоза. Как только движения ушных раковин возобновятся, переместите рыб в экспериментальные аквариумы для восстановления сил в течение как минимум 24 часов.

Наконец, проведите фиктивную процедуру на отдельной паре рыб, проколов эпителий за четвертой жаберной дугой без разрыва нервов перед усыплением рыбы. Поместите три-четыре миллилитра 4% PFA в сцинтилляционный флакон. Используйте один флакон на жаберную дугу.

Кроме того, возьмите небольшую лодку для сыворотки и наполните ее одним XPBS. Он будет использоваться для стирки салфетки после ее иссечения. Держите все решения на льду.

После усыпления рыбы с помощью передозировки бензокаина используйте тупые щипцы, чтобы поднять завивку с одной стороны головы, и изогнутые ножницы, чтобы отрезать каждый конец плечевой жаберной корзины. Далее с помощью тупых щипцов осторожно возьмите жабру за решетки и приподнимите ее из аурикулярной полости. Немедленно промойте жабры в ледяном одном XPBS, чтобы удалить излишки бензола и крови, и поместите вырезанные жабры во флакон, наполненный 4% PFA, фиксируйте все вырезанные жабры на ночь при четырех градусах Цельсия после фиксации.

Смойте X-S-P-F-A в одном XPBS и поместите ткань в двухмиллилитровую пулюперную трубку, наполненную 1,5 миллилитрами 1%-ного триттона x. Поместите пулевые трубки в шейкер на шесть часов при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы проникнуть в ткань, готовят разведение от одного до 250 каждого первичного антитела, добавляя четыре микролитра первичных антител NKA и ZN 12 в 992 микролитра одного XPBS.

Убедитесь, что оба первичных антитела были выработаны в одном и том же хозяине. Отсадите раствор Triton X и без промывания ткани сначала первичный раствор антител и инкубируйте на шейкере в течение шести часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации аспирируйте раствор первичного антитела и промойте первичное антитело три раза по три минуты каждый.

Использование одного XPBS. Получают вторичное антитело в разведении от одного до 200, смешивая пять микролитров исходного вторичного антитела с 995 микролитрами одного XPBS. После аспирации PBS из последней промывки нанесите вторичное антитело и инкубируйте в течение шести часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия на шейкере.

Наконец, удалите избыток вторичного антитела, промыв ткань три раза в течение пяти минут каждый, как и раньше, после промывки закрепите ткань, сначала поместив жабру в каплю объемом 200 микролитров одного XPBS на плоское предметное стекло микроскопа. Следить за тем, чтобы ткань не высыхала. Отделите жаберные hemi Brinks изогнутыми микроножницами.

Затем поместите каплю одного XPBS и каплю монтажного носителя в углубление вогнутого предметного стекла. Поместите отделенные полуранцы в вогнутую накладку передним краем нити вверх и накройте покровным накладкой края накладки лаком для ногтей. Чтобы предотвратить смещение защитного стекла и смещение ткани, дайте ткани осесть на дно вогнутого предметного стекла в течение 10-15 минут перед визуализацией.

Для получения изображений каждой жаберной дуги выберите случайным образом шесть жаберных нитей, чтобы получить по шесть изображений на каждую жаберную дугу. Используйте обычную конфокальную микроскопию для визуализации ткани, взяв от одного до трех микрометров оптических срезов на следующих изображениях: циты, обозначенные стрелками, были окрашены антителом альфа-5, а нервы, обозначенные стрелками, были окрашены антителом ZN 12. На этом конфокальном изображении жаберной нити контрольной рыбы видна внешняя иннервация с обширным ламельным разветвлением центрального нервного пучка, предположительно происходящим из девятого и 10-го нервов, как видно на врезке.

Некоторые из указанных цитов также иннервируются. На этом изображении показана жаберная нить через два дня после полной двусторонней денервации. Наблюдалось уменьшение центрального нервного пучка, в то время как ламинарная иннервация оставалась в основном неповрежденной.

Здесь жаберная нить, показанная через пять дней после полной двусторонней денервации, демонстрирует, что внешняя иннервация в настоящее время в значительной степени отсутствует. Качественный анализ показывает, что полная двусторонняя денервация вызывает деградацию внешней жаберной иннервации при сохранении нервов с клеточными телами внутри жаберной нити, создавая сеть нервов через нить и в хромоту. Эта процедура может быть объединена с другими методами, такими как измерение потоков ионов с использованием радиоактивных ионов, таких как натрий-22, для ответа на дополнительные исследовательские вопросы.