Иммуногистохимия и множественные Маркировка с антителами из того же вида-хозяина по изучению взрослых гиппокампа нейрогенеза

Общая цель этой процедуры — обойти ограничения непрямой иммунофлюоресценции для изучения нейральных клеток-предшественников. Когда это подходит, первичные антитела от разных видов хозяев недоступны. Первоначально аналог тимидина вводится для маркировки делящихся клеток, после чего ткань собирается, обрабатывается и разрезается на криоучастки.

Затем проводится последовательная множественная иммунофлюоресценция, чтобы начать. Применяется немеченое первичное антитело, которое затем связывается флуоресцентно меченным вторичным антителом. Далее открытые перикопы на первом вторичном антителе блокируются сывороткой от первичного вида антитела, и все иммуноглобулины, которые могли быть распознаны вторым вторичным антителом, покрываются неконъюгированными fab-фрагментами.

Это позволяет обрабатывать ткань вторым первичным антителом, которое может быть помечено другим вторичным антителом. В конечном счете, изображения срезов используются для изучения развития и регуляции нейронных клеток-предшественников в ответ на конкретные стимулы и их участие в определенных функциях мозга. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как одновременная множественная иммунофлюоресценция, заключается в том, что он позволяет обойти проблемы, обычно возникающие из-за необходимости использования первичных антител, выращенных в одном и том же виде хозяина.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейрогенеза взрослых, такие как пролиферация субпопуляций предшественников гиппокампа в ответ на физиологические или фармакологические стимулы, патологии мозга или старение. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что множественная маркировка первичными антителами от одного и того же вида хозяина может привести к нежелательной перекрестной активности антител без адекватной блокировки. Сначала взвесьте животных, которым будет введена инъекция, и приготовьте свежий стоковый раствор тимидина в концентрации 10 мг на миллилитр для инъекции.

Когда раствор будет готов, приготовьте скорректированную по весу дозу в шприце тонкой дозировки с иглой 30 калибра. Затем удерживают мышь за загривок и вводят аналог тимидина внутрибрюшинно в нужный момент времени, глубоко обезболивают мышь и транскардио. Перфузируйте его 10 миллилитрами ледяного PBS, а затем 40 миллилитрами свежего ледяного раствора формальдегида.

Затем рассекаем мозг и фиксируем его в том же фиксаторе после фиксации. Инкубируйте собранные мозги в течение 24 часов в 10% сахарозе при четырех градусах Цельсия. На следующий день переведите мозги в 30%-ную сахарозу и инкубируйте еще 48 часов.

Когда мозги готовы к криозащите, заморозьте их при температуре минус 25 градусов по Цельсию изоп пентан. Позже с помощью криостата вырезают корональные срезы размером 40 микрон для длительного хранения. Переведите секции в раствор антифриза и держите их при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Начните с переноса секций из раствора антифриза в TBS с помощью тонкой щетки. Тщательно промойте секции, начиная с ночной стирки при четырех градусах Цельсия, за которой последуют пять 10-минутных стирк при комнатной температуре. Все эти инкубации должны выполняться при непрерывном осторожном перемешивании.

Если один из представляющих интерес антигенов является аналогом тимидина, то на этом этапе необходимо провести стадию денатурации соляной кислотой, за которой следует стадия нейтрализации в буфере канала ствола. Продолжайте проводить проницаемость и блокирование неспецифических сайтов связывания антител при TBS plus. Дайте этой инкубации продолжаться в течение одного часа при комнатной температуре, затем инкубируйте в первом первичном антителе, разведенном в TBS, плюс в течение ночи при четырех градусах Цельсия на следующий день.

Промойте срезы три раза в TBS и один раз в TBST. Дайте каждой ванне постоять 10 минут. Затем инкубировать в первом флюорохроме конъюгированное вторичное антитело в течение трех часов при комнатной температуре.

С этого момента защищайте секции от воздействия света. После еще одной серии промывки перенесите срезы в 10%-ный раствор сыворотки видов-хозяев, из которого были изготовлены два первичных антитела. Инкубируйте срезы в этом растворе в течение трех часов, чтобы насытить открытые перикопы на первом вторичном антителе.

Позже смойте три раза в TBS и один раз в TBST, чтобы удалить сыворотку. Затем приготовьте раствор TBS plus с концентрацией 50 мкг на миллилитр неконъюгированных моновалентных fab-фрагментов, направленных против хозяина вида первичного антитела. Он охватывает эпитопы, которые в противном случае могли бы быть распознаны вторым вторичным антителом.

Переложите срезы в этот раствор и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации срезы промыть не менее трех раз в TBS и один раз в TBST. Во время переноса смажьте сетчатые вставки, содержащие срезы, на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки производства.

Теперь инкубируйте срезы второго первичного антитела в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После очередной серии полоскания нанесите второе вторичное антитело на три часа при комнатной температуре. Наконец, промойте срезы три раза в TBS и приступайте к монтажу желатина срезов.

Высушите слайды на воздухе и закройте их с помощью монтажного носителя ANTIFA. Флуоресцентно размеченные срезы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Делайте стопки изображений в случайных положениях по всей длине зубчатой извилины с 400-кратным увеличением.

Проанализируйте не менее 50 случайно выбранных ячеек, представляющих интерес для каждого полушария, для совместного обозначения различных маркеров. Чтобы рассчитать абсолютные числа для конкретных популяций клеток новорожденных, умножьте процентное соотношение меченых ко-меченых клеток на общее количество клеток новорожденных, оцененное по результатам анализа окрашивания DAB. Описанные методы были использованы для количественной оценки и характеристики клеток новорожденных в постнатальном и взрослом гиппокампе с дефицитом нейрогенеза.

Модель мышей с двумя нокаутами, окрашивание DAB различными маркерами пролиферации, такими как KI 67 или BRDU, последовательно выявляла различия в количестве клеток новорожденных между мышами дикого типа и нокаутными мышами. Меченые BRDU клетки новорожденных могут быть фенотипированы с помощью обычного протокола множественной иммунофлюоресценции, предусматривающего одновременное применение первичных антител против гнезда B-R-D-U-G-F-A-P в GFP и двойного куртена. Это позволило успешно идентифицировать новорожденных клетки-предшественники первого типа, второго типа А, второго типа В и третьего типа в одном образце.

В качестве альтернативы, с более длительными временными интервалами между введением BRDU и умерщвлением животного, окончательное количество нейронов новорожденного может быть проанализировано путем одновременного иммуноокрашивания BRDU new n. Протокол последовательного иммуномаркировки отлично работал, если срезы сначала инкубировали одновременно с антителами против KI 67 у кролика, у козы против GFP и у морской свинки против двойного кордона, а во-вторых, с антителом к GFAP у кролика, но не наоборот. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать до четырех различных антигенов в одном тканевом участке с использованием первичных антител, выращенных в одном и том же хозяине.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о включении соответствующих мер контроля, чтобы исключить возможность антител, перекрестной реактивности или ложноположительных результатов. Имейте в виду, что последовательность инкубации первичных антител может сильно повлиять на результат протокола.