Loop-опосредованной изотермический амплификации (ЛАМП) Анализы на конкретные виды обнаружения

Общая цель этой процедуры заключается в диагностировании возникновения паразитов вида I myea у курицы или куриного стада. Это достигается путем предварительной подготовки реагентов для петлевой изотермической амплификации или ламповой реакции. Затем посмертно получают общую геномную ДНК из одного или нескольких участков кишечника.

Затем геномную ДНК добавляют в мастер-смесь лампы и инкубируют. Наконец, оцениваются результаты испытания лампы. В конечном счете, LAMP используется для определения встречаемости конкретных видов I. miria для улучшения управления запасами и в качестве инструмента для диагностики заболеваний.

Таким образом, основное преимущество этой методики перед традиционными методами, такими как морфологическая микроскопия или ПЦР, заключается в том, что она менее субъективна и не требует дорогостоящего лабораторного оборудования. Использование этого подхода может улучшить здоровье и благополучие цыплят за счет улучшения диагностики инфекции Arian. Чтобы подготовить шаблон для азы лампы Эрея, выберите участок кишечника, который будет исследован.

Используйте эту таблицу в качестве руководства по выбору места отбора проб и наиболее вероятных видов eria. Это имеет ключевое значение, поскольку каждый вид, который заражает цыплят, определяется областью кишечника, на которую он воздействует с помощью стерильных ножниц или скальпеля. Отрежьте пять сантиметров или более длины срезов кишечника, выбранных для исследования на эриа.

Разрежьте образец в продольном направлении. Удалите большую часть содержимого кишечника и используйте край стерильного стеклянного микроскопа. Сдвиньте или простерилизуйте лезвие ножниц, чтобы соскоблить клетки со слизистого слоя

Поместите соскобленный материал в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 100 микролитров стерильного TE весом 10%, но объемную ячейку X 100 смолы, и крепко закрутите сверху. Энергично встряхните образцы в течение одной минуты, затем выдержите на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После закипания дайте каждому образцу остыть при температуре окружающей среды в течение одной-двух минут.

Центрифугируйте образцы при 10 000 G в течение одной минуты перед сбором двух микролитров надосадочной жидкости на каждый анализ лампы, который будет использоваться в качестве шаблона для приготовления грунтовочных материалов для ламп I, достаточных для 100 анализов. Восстановите каждый лиофилизированный праймер для лампы I miria, добавив молекулярную воду в концентрацию 100 микромоляров пипеткой и 60 микролитров молекулярной воды в отдельную микроцентрифугу объемом 0,5 миллилитра с откидной крышкой для каждого анализируемого вида ириа. Используя объем, указанный в этой таблице.

Добавьте в воду грунтовки, F-I-P-B-I-P-F, три B, три LF и LB, специфичные для целевых видов эрии. Создание серии из семи смесей грунтовок для конкретных видов. Кратковременно инвертируйте растворы грунтовки, смешайте их, импульсируйте микрофуги и заморозьте до тех пор, пока не потребуется.

Используя объемы, перечисленные в этой таблице, и указания в текстовом протоколе, приготовьте мастер-смесь для реакции лампы для каждого вида ириа, подлежащей анализу, для проведения лампового анализа пипеткой 23 микролитра специфичной для IEA полимеразной смеси B-S-G-D-N-A полимеразной лампы в 0,5 миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Добавьте два микролитра предварительно подготовленного шаблона ДНК, сделав итоговый объем реакции 25 микролитров в качестве положительного контроля. Добавьте два микролитра специфической геномной ДНК вида eria в одну реакцию.

Добавьте два микролитра молекулярной воды в реакцию в качестве отрицательного контроля, инкубируя водяную баню или тепловой блок при температуре 62 градуса Цельсия в течение 30 минут. По желанию деактивируйте B-S-T-D-N-A полимеразу, нагревая до 80 градусов Цельсия в течение 10 минут. Если реакция не будет прочитана сразу по завершении инкубации при комнатном освещении, оцените цвет каждой реакции на глаз.

Отрицательные результаты будут иметь розовый или фиолетовый цвет, а положительные результаты появятся. Небесно-голубой по желанию. Чтобы подтвердить результат анализа лампы, смешайте пять микролитров продукта реакции лампы с одним микролитром буфера для загрузки геля ДНК и запустите на прекрасьте 2% геля ARO.

Используйте лестницу молекулярного размера ДНК с одним киллерным основанием для определения размера фрагмента, тестируя три. Птицы, собранные на бройлерной ферме в США в рамках программы эпиднадзора, дали три комплекта проб кишечника, как показано здесь. Целенаправленное применение видоспецифичных ламповых анализов и приоритизация предпочтительных кишечных участков для каждой I-мирии.

Виды позволили визуально идентифицировать ириевую инфекцию у всех протестированных птиц с использованием гидроксинатального синего в качестве индикатора. Цвет, достигаемый при негативной реакции лампы при использовании гидрокси, может варьироваться от фиолетового до розового, но всегда отличается от голубого, достигаемого положительным результатом. Подтверждение с помощью электрофореза в геле дало результаты, сравнимые с показанными здесь.

Подготовка ДНК из одного образца от каждой птицы, представляющего материал, собранный с каждого из конкретных участков кишечника и протестированный с помощью всех семи анализов лампы, обеспечила тот же результат, что и при обработке каждого участка кишечника отдельно. Другие методы, такие как оценка поражений, также могут быть выполнены для оценки общего состояния кишечника.