Золото наностержней при содействии оптического Стимуляция нервных клеток

В этом протоколе описывается, как использовать переходный нагрев, связанный с оптическим поглощением золотых наностержней, для стимуляции дифференцировки и внутриклеточной активности кальция в нейрональных клетках. Эти результаты потенциально открывают новые возможности для применения в нейронных протезах и фундаментальных исследованиях в нейронауке.

Общая цель этой процедуры заключается в стимуляции нейрональных клеток, культивируемых с помощью золотых наностержней, с помощью лазерного диода ближнего инфракрасного диапазона. Это достигается путем предварительной подготовки наночастиц золота с правильной оптической плотностью. Второй шаг заключается в культивировании нейронных клеток и добавлении к ним наночастиц.

Следующим этапом является лазерное облучение. Последним шагом является проверка дифференцировки клеток через бета-3 к экспрессии тубулина. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для того, чтобы показать внутриклеточную транзиторность кальция.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы искали способ стимулировать потенциал действия в отдельных нейронах в клеточной популяции. Демонстрировать процедуру будут Джейми Мэй и студенты бакалавриата из нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, поместите ветеринарный раствор наностержня золота в УФ-видимый спектрофотометр.

Измерьте начальную оптическую плотность, записав значения поглощения от 300 нанометров до 1000 нанометров с разрешением от 0,5 до двух нанометров. Приготовьте стоковый раствор объемом в один миллилитр, разбавив исходный образец золота аноро до оптической плотности одной центрифуги. Один миллилитр раствора золотого наностержня дважды для удаления любых химических излишков.

Затем удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте золотые наностержни в деионизированной воде. Чтобы подготовиться к применению в клеточной культуре, произведите ультразвуковую обработку раствором золота Аноро в течение пяти минут, а затем простерилизуйте его ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут. В этой процедуре готовят 500 миллилитров стерильного дмем для среды для клеточных культур.

Затем вырастите нейронные клетки NG 1 0 8 15 в 10 миллилитрах среды для культивирования клеток в колбе с температурой Т 75, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и увлажненной атмосфере. Когда клетки слились на 70-80%, смените среду на теплую свежую среду. После этого механически отсоедините ячейки, аккуратно постучав по дну сливающейся колбы.

Центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут при 600 G и повторно суспендируйте клеточную палитру в двух миллилитрах теплой среды для дифференцировки клеток. Затем посмотрите на клетки в 96-луночном планшете с 200 микролитрами среды для дифференцировки клеток. Инкубируйте образец в течение одного дня при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день добавьте раствор золотого наностержня и инкубируйте его еще 24 часа. В этой процедуре соедините лазер с одномодовым оптическим волокном и завершите его разъемом FC. Измерьте выходную мощность лазера с помощью стандартного измерителя мощности на третий день инкубации наностержней.

Закрепите разъем ФК в лунке, облучайте образец и контроль при комнатной температуре в течение одной минуты непрерывной волной при различных мощностях лазера на пятые сутки, удалите из образца среду дифференцировки клеток и зафиксируйте ее раствором формальдегида 3,7% объемного на объемный раствор формальдегида на 10 минут. Затем проведите через ячейки 0,1% объема на объем Triton X 100 в течение 20 минут. После этого добавьте 3% веса на объем BSA в образец на 60 минут.

Чтобы блокировать нереактивные сайты связывания с белками, пометьте образец антибета-3 тубулином на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день инкубируйте клетки в течение 90 минут в темноте с подходящим вторичным антителом. Затем пометьте ядра клеток DAP E в течение 10 минут.

Затем визуализируйте образец с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии с использованием объектива не менее 20 раз. Выберите фильтры микроскопа в соответствии с вторичным антителом и выберите фильтр DAPI для визуализации ядра клетки. На этом этапе приготовьте 20% массовый раствор ONIC F1 27, растворив два грамма растворенного вещества в 10 миллилитрах ДМСО.

Нагрейте раствор оника F1 27 при 40 градусах Цельсия в течение 20 минут для повышения растворимости. На третий день инкубации анаро приготовьте сбалансированный солевой раствор. Далее удалите среду для дифференцировки клеток и замените ее раствором BSS.

Дополнен пятью микромолярами гриппа, 4:00 утра в ДМСО и 0,1% веса на объем стокового раствора onic F1 27. После этого соедините лазер с одномодовым оптическим волокном и отрежьте кончик. Использование стандартной методики.

Понаблюдайте за полученным наконечником под оптическим микроскопом, чтобы убедиться, что наконечник плоский и перпендикулярен оси волокна. Затем измерьте выходную мощность лазера с помощью стандартного измерителя мощности. Затем вставьте волокно для подачи света в держатель оптического волокна и прикрепите его к микропозиционеру.

После этого подключите осциллограф к генератору сигналов. Для контроля оптической модуляции. Используйте двоичный сигнал с переменной частотой и длиной импульса.

Затем подключите лазер и используйте сигнал модуляции в качестве входного TTL для микроскопа. Используйте аргоновый ионный лазер для возбуждения интернализованного красителя гриппа в 4:00 утра и синхронизированного лазера dde. Для возбуждения нанопалов эндоцитозы поместите клетки под перевернутый конфокальный микроскоп и расположите светоносящее волокно вдали от клетки-мишени в режиме пропускающего освещения.

Затем рассчитайте радиус луча у цели. Выполните визуализацию образца и контроль при комнатной температуре с использованием объектива 40 x и соберите сканы временных рядов с разрешением 256 x 256 пикселей на кадр в режиме кругового обзора. Затем выполните запись без какого-либо лазерного возбуждения DIO, чтобы идентифицировать любую базовую инференцию аргон-ионного лазера, показанная здесь, представляет собой эпифлуоресцентное изображение дифференцированных клеток NG 1 0 8 15 roal, культивируемых отдельно и облучаемых лазерной мощностью 7,5 Вт квадратного сантиметра.

А это изображение клеток, культивируемых золотыми наностержнями, облученными лазерной мощностью 1,25 Вт в квадрате сантиметра. Вот пример дифференцированного NG 1 0 8 15 нейронных клеток, загруженных индикатором кальция гриппа о 4:00 AM. Изображение было получено с помощью инвертированного конфокального микроскопа с 40-кратным масляным иммерсионным объективом.

На этом рисунке показаны репрезентативные образцы вариаций кальция, индуцированных лазером, в зависимости от времени. В NG 1 0 8 15 нейрональные клетки культивировали в бессывороточных условиях в течение трех дней с золотыми наностержнями из полистиролсульфоната, золотыми нанопалочками и без наностержней. F max больше F zero указывает на увеличение максимальной флуоресценции, обнаруженной в нейрональных клетках NG 1 0 8 15 После его развития.

Этот метод проложил путь к будущему применению в оптическом моделировании нейронных клеток.