Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

В этом эксперименте проводится скрининг химических библиотек на наличие соединений, которые модулируют механизмы посттранскрипционного контроля через три основные нетранслируемые области транскриптов. Во-первых, определите три основные нетранслируемые области интереса в целевом гене. Клонируйте эти три основных UTR в репортерную плазмиду El luciferase control, чтобы создать химерный транскрипт El luciferaza с тремя простыми UTR.

Затем стабильно. Интегрировать две плазмиды в клеточную линию, относящуюся к заболеванию, засеять клетки, несущие химерный транскрипт в 96. Планшеты обрабатывают их библиотекой соединений в течение 24 часов, а затем определяют молекулы, влияющие на активность люциферазы.

Выберите выбранные молекулы для дальнейшего валидационного скрининга, а затем обработайте как контрольные клетки, так и клетки, несущие люциферазу с тремя основными UTR-химерными транскриптами, с помощью подмножества тщательно отобранной библиотеки. Результаты будут различаться, является ли эффект соединения опосредованным через три простые нетранслируемые области или через другие векторные последовательности. В отличие от большинства репортерских отборочных эссе.

Анализы, которые сосредоточены на регуляции транскрипции, эти анализы на основе клеток сосредоточены на идентификации соединений, которые модулируют уровни транскриптов мРНК через три основные и транслируемые области. Соберите стабильно трансфицированные клетки нейробластомы с помощью трипсина азиатского. Разбавляют клетки до концентрации в два раза по 10 до пятой клетки на миллилитр.

В RPMI содержится 10% FBS и 1% L-глутамина на 27 пластин. Приготовьте не менее 250 миллилитров клеточной суспензии, учитывая работу с жидкостью, мертвые объемы и повторяющиеся этапы пипетирования. Затем вылейте клеточную суспензию в стерильный резервуар и поместите ее на стол робота.

Загрузите девять белых плоских товаров со штрих-кодом. Дно 96 луночных планшетов и коробка со стерильными наконечниками для пипеток объемом 200 микролитров на столе робота. Смешайте клеточную суспензию, затем распределите по 75 микролитров клеток в каждую лунку из девяти планшетов.

Накройте пластины и дайте ячейкам отложиться на дно лунки в течение 30 минут, чтобы свести к минимуму краевые эффекты. Затем поместите все девять пластин при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и инкубируйте в течение 24 часов. Точно так же приступайте к оставшимся тарелкам по девять за раз.

Разморозьте составные библиотечные пластины при комнатной температуре. Заполните одну корыто стерильным PBS, а другую — 0,5% DMSO в растворе PBS и поместите их на стол робота. Для каждой библиотечной таблички.

Подготовьте и промаркируйте соответствующим образом. Одна пластина для разбавления. Теперь заполните каждую лунку колонок, от двух до 11 разбавляющих планшетов 398 микролитрами стерильного PBS.

Затем заполните колонки 1 и 12 50 микролитрами 0,5% ДМСО в стерильном PBS. Затем загрузите две разбавляющие пластины. Две библиотечные тарелки, две коробки по 50 микролитров стерильных наконечников и шесть клеточных тарелок на столе робота.

Теперь раскройте клеточные планшеты, пипетируйте два микролитра 10-миллимолярного стокового раствора из одного из двух библиотечных планшетов в соответствующей разбавляющей пластине и хорошо перемешайте. Используя тот же набор советов. Перенесите три микролитра 50 микромолярного разведения в три белые 96-луночные планшеты со штрих-кодом, содержащие клетки.

Замените полный набор наконечников и повторите индукцию элементов для второй библиотечной пластины. Накройте культуры и инкубируйте в течение 24 часов. Затем повторите процесс разведения соединения и индукции клеток для оставшихся библиотечных планшетов.

Восстановите реагент люциферазы по выбору до комнатной температуры. Поместите резервуар с люциферазой на стол робота и налейте в него реагент. Извлеките из инкубатора девять тарелок с индуцированными культурами.

Поместите их на стол робота, откройте крышку и уравновесьте до комнатной температуры. Затем добавьте 50 микролитров реактива люциферазы на лунку между пластинами. Введите задержку, равную времени считывания люминесценции одной пластины.

После 30-минутной инкубации. Сначала запишите штрих-код номерного знака, чтобы связать его с соответствующим файлом данных. Далее поместите первую пластину в люминометр и измерьте люминесценцию.

После короткого шага встряхивания повторите показания люминесценции для всех пластин индукции. Затем соберите оставшийся реагент расы Люцифера и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию. После обработки экспериментальных данных первичного скрининга выберите попадания для подтверждения специфичности соединения с помощью встречного скрининга вишни.

Выберите выбранные хиты и создайте макет для новой просеивающей пластины, включая позиции для элементов управления. Затем из аликвот, хранящихся в одиночных трубках со штрих-кодом 2D, создать новые пластины HIIT. Следуя этому же протоколу и для скрининга.

Приготовьте 3 96 луночных планшета каждой стабильной клеточной линии на каждый планшет. На следующий день обработайте клетки библиотечными составами. С помощью каждого планшета Hi Plate обрабатывают три планшета CHP 1 34 micken, три прайм-UTR и три планшета с контрольными клетками в двух микромолярных рабочих концентрациях в течение 24 часов.

Измерьте активность люциферазы во всех планшетах CHP 1 34, трех простых нетранслируемых и контрольных наборах. Как и в случае с анализом данных при первичном скрининге, нормализуйте экспериментальные данные из обработанных скважин до среднего значения контрольных показателей, обработанных на пластинчатых транспортных средствах. Затем рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение по репликациям для каждого тестируемого составного вычисления.

Кратное изменение активности люциферазы в CHP 1 34 McIn три простых UTR по сравнению с CHP 1 34. Контрольные ячейки выбирают произвольные пороговые значения полного изменения больше 1,5 и значения значимости P меньше 0,01. В этом эксперименте был проведен скрининг библиотеки соединений 2000 года на предмет потенциальных модуляторов механизмов посттранскрипционного контроля, оказываемых через три основных UTR микрофона и онкогена, результаты сигналов люциферазы одного из 25 репрезентативных библиотечных пластин отображались в процентах от обработанного носителя.

Контрольные исследования показывают, что большинство соединений не оказывают видимого влияния на три простых UTR. Попадания были выбраны, в которых среднее значение и стандартное отклонение были рассчитаны по всем значениям анализа, соединения, снижающие активность люциферазы ниже 20%, с наибольшей вероятностью указывают на выраженную клеточную токсичность соединения. На этом графике представлены репрезентативные результаты встречного скрининга четырех выбранных соединений, обозначенных как WX, Y и Z. Оба соединения W и X приводят к увеличению экспрессии люциферазы из трех основных репортеров онкогена, на что указывает разница в изменении кратности и T-критерий Обратите внимание, что в то время как эффекты обоих соединений W и X действительно зависят от трех основных соединений UTR, W не оказывает существенного влияния на жизнеспособность клеток.

В то время как соединение X проявляет некоторую цитотоксическую активность, о чем свидетельствует нормализованный сигнал люциферазы в контрольных клетках CHP 1 34, ни соединение Y, ни соединение Z в двух микромолярных концентрациях не проявляют зависимого влияния на уровни люциферазы в трех основных UTR. Снижение активности люциферазы, выявленное при первичном скрининге при лечении соединением Y, скорее является следствием цитотоксичности. В случае соединения Z повышенная активность люциферазы обусловлена неспецифичной с точки зрения трех основных UTR активацией вирусного промотора.

В этом высокопроизводительном анализе следует помнить, что проверка первичного тепла в контрольных клетках имеет решающее значение для различения соединений, которые действуют через три основные нетранслируемые области, от тех соединений, которые действуют через промотор.